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SseK2蛋白是位于毒力岛2（SPI-2）上的一种新型转运蛋白，在沙门菌染色体基因组上高度保守且SseK2在系统性疾病中发挥着重要作用。本研究通过重组自杀性质粒（ pRE112 ）介导的细菌同源重组技术敲除sseK2基因，构建SL1344ΔsseK2缺失菌株，并对其主要生物学特性和免疫学特性进行研究，同时探究SseK2蛋白的免疫学特性，为进一步研究sseK2基因在鼠伤寒沙门菌致病过程中的作用奠定理论基础。主要研究内容如下：
1. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株的构建与鉴定
构建重组自杀性质粒 pRE-ΔsseK2，将其转化至大肠杆菌 χ7213 中构建重组菌株，并以此菌株为供体菌，以鼠伤寒沙门菌 SL1344 株为受体菌进行共同培养，并通过自杀性质粒介导的同源重组筛选缺失菌株 SL1344ΔsseK2，再将克隆出的 sseK2 基因连接至 pBR322 载体构建重组质粒 pBR-sseK2 ，并电转至SL1344ΔsseK2缺失菌株中构建互补菌株SL1344CΔsseK2。
2. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株生物学特性
分别以鼠伤寒沙门菌株 SL1344 亲本菌株、SL1344ΔsseK2 缺失菌株及SL1344CΔsseK2 互补菌株为研究对象，试验结果表明，敲除 sseK2 基因不影响鼠伤寒沙门菌的表型、血清型和生长特性等，但其生物被膜的形成能力显著降低（P＜0.05）。SL1344ΔsseK2 缺失菌株与亲本菌株 SL1344 均能刺激巨噬细胞产生更高水平的乳酸和丙酮酸（P＜0.05），但前者强于后者；ATP 也得到了相似的结果，且差异极显著（P＜0.01）。但是，与空白对照组相比，SL1344 株能刺激巨噬细胞产生更高水平的己糖激酶（HK）（P＜0.01），SL1344ΔsseK2株则不能（ P＞0.05 ）。小鼠毒力试验结果表明， SL1344ΔsseK2 缺失菌株与亲本菌株SL1344 的半数致死量（ LD50 ）分别为 3.44×108 菌落形成单位（ CFU ）和2.12×105 CFU，其毒力下降 1620 倍；另外，小鼠体内动态分布的检测结果表明，缺失菌株 SL1344ΔsseK2 在不同脏器中的细菌数量均低于亲本菌株 SL1344 （P＜0.05）。表明 sseK2 基因是沙门菌的毒力相关基因，且能够影响巨噬细胞对糖酵解的能力。
3. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株免疫学特性
分别以鼠伤寒沙门菌株 SL1344 亲本菌株、SL1344ΔsseK2 缺失菌株及SL1344CΔsseK2 互补菌株为研究对象，免疫学特性检测结果显示：敲除 sseK2基因对 HeLa 细胞和巨噬细胞J774A.1的黏附和侵入能力影响很小（P＞0.05）；但 SL1344ΔsseK2 缺失菌株感染组在巨噬细胞内细菌增殖数量显著低于 SL1344亲本菌株感染组（P＜0.05）。淋巴细胞增殖活性试验显示：不同菌株免疫组的刺激指数均在21 d达到最高值。在不同时间点SL1344ΔsseK2缺失菌株免疫小鼠后血清中 IgG 抗体含量明显升高，且免疫保护效力为 62.5%，但与候选疫苗株SL1344Δcrp 相比，缺失菌株 SL1344ΔsseK2 的 IgG 抗体含量以及免疫保护效率均降低。表明sseK2基因的敲除能够降低机体对鼠伤寒沙门菌所产生的体液免疫应答水平，减弱鼠伤寒沙门菌所产生的免疫学活性。
4. 鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白免疫学特性
利用生物信息学相关软件对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析，同时构建表达载体 pET-32a-sseK2，大肠杆菌原核表达、纯化后经 SDS-PAGE 和Western blotting鉴定，并检测重组蛋白诱导细胞产生的细胞因子含量变化、测定不同浓度 SseK2 蛋白免疫小鼠血清细胞因子含量及蛋白免疫小鼠后的免疫保护率。结果显示，重组蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达；Western blotting结果表明表达蛋白具有良好免疫原性；不同浓度的蛋白能够促进巨噬细胞分泌 IL-4、IL-6、IL-1β和IFN-γ；同时免疫125 ng/mL重组蛋白后小鼠血清中的细胞因子的分泌量呈倒“V”型变化；免疫保护率结果显示，250 ng/mL重组蛋白免疫小鼠后的免疫保护率最高为 25%。表明 SseK2 蛋白能够刺激机体产生相应的免疫应答反应且参与机体细胞因子的分泌。
1. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株的构建与鉴定
构建重组自杀性质粒 pRE-ΔsseK2，将其转化至大肠杆菌 χ7213 中构建重组菌株，并以此菌株为供体菌，以鼠伤寒沙门菌 SL1344 株为受体菌进行共同培养，并通过自杀性质粒介导的同源重组筛选缺失菌株 SL1344ΔsseK2，再将克隆出的 sseK2 基因连接至 pBR322 载体构建重组质粒 pBR-sseK2 ，并电转至SL1344ΔsseK2缺失菌株中构建互补菌株SL1344CΔsseK2。
2. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株生物学特性
分别以鼠伤寒沙门菌株 SL1344 亲本菌株、SL1344ΔsseK2 缺失菌株及SL1344CΔsseK2 互补菌株为研究对象，试验结果表明，敲除 sseK2 基因不影响鼠伤寒沙门菌的表型、血清型和生长特性等，但其生物被膜的形成能力显著降低（P＜0.05）。SL1344ΔsseK2 缺失菌株与亲本菌株 SL1344 均能刺激巨噬细胞产生更高水平的乳酸和丙酮酸（P＜0.05），但前者强于后者；ATP 也得到了相似的结果，且差异极显著（P＜0.01）。但是，与空白对照组相比，SL1344 株能刺激巨噬细胞产生更高水平的己糖激酶（HK）（P＜0.01），SL1344ΔsseK2株则不能（ P＞0.05 ）。小鼠毒力试验结果表明， SL1344ΔsseK2 缺失菌株与亲本菌株SL1344 的半数致死量（ LD50 ）分别为 3.44×108 菌落形成单位（ CFU ）和2.12×105 CFU，其毒力下降 1620 倍；另外，小鼠体内动态分布的检测结果表明，缺失菌株 SL1344ΔsseK2 在不同脏器中的细菌数量均低于亲本菌株 SL1344 （P＜0.05）。表明 sseK2 基因是沙门菌的毒力相关基因，且能够影响巨噬细胞对糖酵解的能力。
3. 鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK2缺失菌株免疫学特性
分别以鼠伤寒沙门菌株 SL1344 亲本菌株、SL1344ΔsseK2 缺失菌株及SL1344CΔsseK2 互补菌株为研究对象，免疫学特性检测结果显示：敲除 sseK2基因对 HeLa 细胞和巨噬细胞J774A.1的黏附和侵入能力影响很小（P＞0.05）；但 SL1344ΔsseK2 缺失菌株感染组在巨噬细胞内细菌增殖数量显著低于 SL1344亲本菌株感染组（P＜0.05）。淋巴细胞增殖活性试验显示：不同菌株免疫组的刺激指数均在21 d达到最高值。在不同时间点SL1344ΔsseK2缺失菌株免疫小鼠后血清中 IgG 抗体含量明显升高，且免疫保护效力为 62.5%，但与候选疫苗株SL1344Δcrp 相比，缺失菌株 SL1344ΔsseK2 的 IgG 抗体含量以及免疫保护效率均降低。表明sseK2基因的敲除能够降低机体对鼠伤寒沙门菌所产生的体液免疫应答水平，减弱鼠伤寒沙门菌所产生的免疫学活性。
4. 鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白免疫学特性
利用生物信息学相关软件对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析，同时构建表达载体 pET-32a-sseK2，大肠杆菌原核表达、纯化后经 SDS-PAGE 和Western blotting鉴定，并检测重组蛋白诱导细胞产生的细胞因子含量变化、测定不同浓度 SseK2 蛋白免疫小鼠血清细胞因子含量及蛋白免疫小鼠后的免疫保护率。结果显示，重组蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达；Western blotting结果表明表达蛋白具有良好免疫原性；不同浓度的蛋白能够促进巨噬细胞分泌 IL-4、IL-6、IL-1β和IFN-γ；同时免疫125 ng/mL重组蛋白后小鼠血清中的细胞因子的分泌量呈倒“V”型变化；免疫保护率结果显示，250 ng/mL重组蛋白免疫小鼠后的免疫保护率最高为 25%。表明 SseK2 蛋白能够刺激机体产生相应的免疫应答反应且参与机体细胞因子的分泌。