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第一部分Humanin在多囊卵巢综合征氧化应激中的作用及机制研究【目的】研究线粒体多肽humanin在多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）患者和仅因男方因素而行IVF/ICSI辅助生殖技术助孕的对照患者的血清和卵泡液中的浓度差异以及卵巢颗粒细胞中humanin m RNA的表达差异;外源性给予humanin衍生物S14G-HN（HNG）对PCOS大鼠体重、卵巢重量、激素水平、卵泡发育及排卵的影响,以及对卵巢局部和血清中氧化应激相关指标如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平的影响;用甲萘醌又叫维生素K3（vitamin K3,vit K3）体外构建卵巢颗粒细胞系COV434及原代大鼠颗粒细胞氧化应激损伤模型探索humanin缓解氧化应激损伤的具体分子机制。【方法】研究共招募了44位年龄在20-40岁寻求IVF/ICSI辅助生殖技术助孕的女性,其中按鹿特丹标准诊断为多囊卵巢综合征16人（PCOS组）,另外28位患者为仅因男方因素而行IVF/ICSI辅助生殖技术受孕的对照患者（Control组）。统计了其临床和流行病学特征。收集其血清、卵泡液及卵巢颗粒细胞,用ELISA法检测humanin在两组患者血清和卵泡液中的浓度,q RT-PCR法检测humanin m RNA在两组患者卵巢颗粒细胞中的表达;从华中科技大学同济医学院实验动物中心购买21日龄断奶的雌性Sprague Dawley（SD）大鼠60只,从中随机选取48只用脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）（6mg/100g体重）溶于0.2m L芝麻油皮下注射21d构建PCOS大鼠模型,对照组（n=12）每天皮下注射0.2m L芝麻油。注射DHEA 14 d后,将模型动物随机分为4组,每组12只,其中一组继续皮下注射DHEA 7d（PCOS组）,另外三组同时皮下注射DHEA 7d和腹腔注射低、中、高剂量（2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）的HNG 14d（PCOS+2.5mg/kg HNG组、PCOS+5 mg/kg HNG组、PCOS+10mg/kg HNG组）。统计各组大鼠体重和卵巢重量,采集各组大鼠血液样本,收集子宫和卵巢组织,探讨外源性给予humanin衍生物HNG对大鼠体重、卵巢重、卵巢形态、激素水平、卵巢局部及全身氧化应激指标的影响;用梯度（0、20、40、60、80、100、120μM）和（0、10、20、30、40、50、60μM）vit K3分别处理卵巢颗粒细胞系COV434和原代大鼠颗粒细胞24h,CCK8法检测细胞活力,选择细胞活力为50%左右的vit K3浓度作为引起颗粒细胞中度氧化应激损伤的vit K3浓度。同时用引起卵巢颗粒细胞中度氧化应激损伤的vit K3浓度和梯度HNG（0、2.5、5、10、15、20μg/ml）处理COV434,24h后CCK8法测细胞活力,选择使细胞活力恢复到与正常对照组细胞无显著差异的HNG浓度作为HNG缓解卵巢颗粒细胞中度氧化应激损伤的浓度。将COV434细胞设置为空白对照组、vit K3组以及vit K3+HNG组,处理24h后收集细胞,WST-1法检测各组细胞中SOD和MDA水平,q RT-PCR和western blotting法检测各组细胞中kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1/核因子E2相关因子2/抗氧化反应原件（Keap1/Nrf2/ARE）信号通路相关基因和蛋白的表达水平,免疫荧光法和western blotting法验证外源性加入HNG促进Nrf2从细胞质向细胞核的转位激活。【结果】我们发现与对照组患者相比,PCOS组患者黄体生成素（luteinizing hormone,LH）、血清总睾酮、抗苗勒氏管激素（anti miillerian hormone,AMH）、胰岛素水平、胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMAIR）相比于对照组患者显著增加（p=0.038、0.045、0.003、0.028、0.044）。PCOS患者血清中的humanin浓度与对照组患者无显著差异（p=0.642）,而PCOS患者卵泡液中humanin浓度和卵巢颗粒细胞中humanin m RNA的表达水平相比于对照组显著降低（p=0.024,0.021）;PCOS组大鼠体重和卵巢重量相比于对照组大鼠显著增加,外源性给予低、中、高剂量（2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）的HNG均能够显著的降低PCOS大鼠的体重和卵巢重量。大鼠卵巢组织HE染色发现PCOS大鼠卵巢组织中出现典型的囊状卵泡,并且PCOS组大鼠卵巢组织中黄体数目相比于对照组显著减少,而闭锁卵泡与囊状卵泡数显著增加,外源性给予HNG能够显著提高PCOS大鼠黄体数并降低闭锁卵泡和囊状卵泡数。PCOS组大鼠血清E2和DHEA水平相比于对照组大鼠显著增加,外源性给予中,高剂量（5mg/kg,10mg/kg）的HNG能够显著降低PCOS大鼠血清E2和DHEA的水平。外源性给予HNG同样能够显著提高PCOS大鼠血清和卵巢局部SOD和CAT水平并降低MDA的水平;体外细胞实验中我们发现80μM的vit K3能够使细胞活力减少50%左右即引起COV434细胞中度氧化应激损伤,同时加入5μg/ml的HNG能够缓解80μM vit K3引起的颗粒细胞氧化应激损伤。80μM vit K3组细胞SOD水平相比对照组显著降低（p=0.02）而MDA水平显著升高（p=0.001）,加入5μg/ml HNG后能够显著逆转vit K3引起的SOD和MDA水平的变化（p=0.01,0.04）,80μM vit K3+5μg/ml HNG组中Nrf2 m RNA和蛋白表达水平相比于对照组显著升高（p=0.002,0.03）,同时其下游分子血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶-1（NQO1）蛋白表达水平显著升高（p=0.001,0.04）。免疫荧光结果表明加入5μg/ml HNG能够促进COV434和原代大鼠颗粒细胞中Nrf2从细胞质向细胞核转位。分别提取COV434细胞质蛋白和细胞核蛋白进行western blotting,结果表明80μM vit K3+5μg/ml HNG组相比于空白对照组和80μM vit K3组Nrf2在细胞质中的表达显著降低（p=0.001,0.002）而在细胞核中的表达显著升高（p=0.004,0.045）。【结论】与对照组患者相比,PCOS患者卵泡液和卵巢颗粒细胞中humanin的表达显著下调;外源性给予humanin衍生物HNG能改善PCOS大鼠内分泌紊乱,促进卵泡发育和排卵,缓解PCOS大鼠氧化应激损伤;humanin通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路缓解卵巢颗粒细胞的氧化应激损伤。第二部分Humanin在多囊卵巢综合征胰岛素抵抗中的作用及机制研究【目的】研究线粒体多肽humanin在多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）合并胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）患者（PCOS with IR）和多囊卵巢综合征不合并胰岛素抵抗患者（PCOS without IR）的血清以及卵泡液中的浓度差异;外源性给予humanin衍生物S14G-HN（HNG）对PCOS大鼠模型空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、空腹胰岛素（fasting insulin,FINS）水平的影响并探索humanin改善PCOS大鼠胰岛素抵抗的分子机制;敲降卵巢颗粒细胞系COV434中humanin的表达并外源性补充HNG探索humanin对卵巢颗粒细胞系COV434糖代谢的影响。【方法】研究共招募83名年龄在20-35岁寻求IVF/ICSI辅助生殖技术助孕的女性,其中47位患者根据鹿特丹标准诊断为多囊卵巢综合征（PCOS组）,另外36位患者为因输卵管或男方因素而采取IVF/ICSI辅助生殖技术助孕的非多囊卵巢综合征对照组患者（non-PCOS组）。当患者血清FINS≥15μIU/m L或胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance HOMA-IR）≥2.0即被诊断为胰岛素抵抗（insulin resistances,IR）。根据患者是否合并胰岛素抵抗又将其分为多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗组（PCOS with IR）、多囊卵巢综合征不合并胰岛素抵抗组（PCOS without IR）、对照合并胰岛素抵抗组（non-PCOS with IR）以及对照不合并胰岛素抵抗组（non-PCOS without IR）。收集她们的卵泡液和月经2-4天的血液样本,ELISA法检测humanin浓度。统计其人口统计学和临床特征包括激素水平、FBG、FINS、HOMA-IR、血胆固醇和甘油三脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平等。分析患者一些临床特点包括抗苗勒氏管激素（anti miillerian hormone,AMH）、睾酮水平、FINS、HOMA-IR与卵泡液中humanin浓度的相关性;从华中科技大学同济医学院实验动物中心购买21日龄断奶的雌性Sprague Dawley（SD）大鼠35只,随机选取28只用脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）（6mg/100g体重）溶于0.2m L芝麻油皮下注射21d构建PCOS大鼠模型,对照组（n=7）每日皮下注射0.2m L芝麻油。注射DHEA 14d后,将模型大鼠随机分为4组,其中一组继续皮下注射DHEA 7d（PCOS组,n=7）,另外三组皮下注射DHEA 7d并同时腹腔注射低、中、高剂量（2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）的HNG 14d（PCOS+2.5mg/kg HNG组、PCOS+5 mg/kg HNG组、PCOS+10 mg/kg HNG组,n=7）。采集血液样本并收集卵巢组织提颗粒细胞,葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠血清FBG,ELISA法检测各组大鼠血清FINS,western blotting法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞中胰岛素受体1/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（IRS1/PI3K/AKT）胰岛素信号通路相关蛋白的表达以研究外源性给予HNG对PCOS大鼠糖代谢的影响;体外细胞实验敲降卵巢颗粒细胞系COV434中humanin的表达并外源性补充HNG,葡萄糖氧化酶法检测24h各组COV434细胞的葡萄糖摄取量,q RT-PCR法检测各组细胞中胰岛素信号通路IRS1/PI3K/AKT以及葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）m RNA的表达水平。分别提取细胞质和细胞膜蛋白western blotting法和免疫荧光法验证COV434细胞及原代大鼠颗粒细胞在外源性补充HNG后GLUT4从细胞质向细胞膜的转位。【结果】我们发现血清中humanin浓度在各组患者中无显著差异。相比于PCOS不合并IR组,PCOS合并IR组患者卵泡液中humanin浓度显著降低（186.56±51.83pg/m Lvs.250.20±47.19 pg/m L,p=0.006）。PCOS患者卵泡液中humanin的浓度与患者的睾酮水平、FINS以及HOMA-IR指数呈显著负相关（p=0.017、p=0.012、p=0.015）;PCOS组大鼠血清中FPG及FINS水平相比于对照组显著增加,外源性给予低、中、高剂量（2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）的HNG能够降低PCOS大鼠血清FPG和FINS的水平。PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞中p-IRS1、p-PI3K、p-Akt及GLUT4的蛋白表达水平相比于对照组显著降低,外源性给予高剂量（10.0 mg/kg）的HNG能够显著提高卵巢颗粒细胞中IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号通路相关蛋白及GLUT4蛋白的表达;用两条已报道过的si RNA序列敲降卵巢颗粒细胞系COV434中humanin的表达,发现转染24小时后humanin的m RNA表达水平降低到对照组的30%以下。通过检测24小时COV434细胞葡萄糖摄取量发现无论是正常组细胞还是humanin敲降组细胞加入低、中、高剂量（1、2.5、5μg/ml）的HNG都能够显著提高COV434细胞24小时的葡萄糖摄取量,并且加入5μg/ml HNG显著提高胰岛素信号通路相关基因IRS1、AKT、GLUT4 m RNA的表达。分别提取COV434细胞细胞膜蛋白和细胞质蛋白进行western blotting检测发现外源性添加5μg/ml HNG后相比于对照组细胞GLUT4在细胞膜的表达显著升高（p=0.02）而在细胞质的表达无显著变化。原代大鼠颗粒细胞免疫荧光发现加入5μg/ml HNG能提高GLUT4的表达并且促进GLUT4从细胞质向细胞膜转位。【结论】PCOS合并IR患者卵泡液中humanin的下调可能参与了PCOS胰岛素抵抗的发生,外源性补充HNG可降低PCOS大鼠FINS和FPG水平,humanin通过调控IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号通路改善PCOS胰岛素抵抗。