鱼藤酮(rotenone)是由醉鱼科植物毛鱼藤(derris)的胶状液汁提取的化学物质，自20世纪40年代以来一直被视为安全有效的杀虫剂而广泛应用于农业除害。但是近年来发现，这个既往被认为对人畜毒性低的农药，对机体的神经系统功能可产生一定影响，特别是它对中枢神经的毒性作用以及可能与帕金森病(Parkinson disease，PD)存在着的潜在联系更是人们关注的焦点。帕金森病的主要病理学特征是黑质致密部多巴胺神经元的丢失以及Lewy小体(Lewy body)的形成。给予鱼藤酮后大鼠能产生这些病理变化，并出现类帕金森病的症状，很好地模拟了人类PD的特征改变。但迄今为止，鱼藤酮与PD发病的相关作用机制仍不十分清楚。因此，从分子水平上揭示鱼藤酮所致PD发生的机制与病理变化的关系对PD的防治具有十分重要的意义。 兴奋毒性作用与PD等神经退变性疾病的关系已成为近年研究的热点之一。目前公认，谷氨酸(glutamate，Glu)引起的兴奋毒性是中枢神经系统出血、创伤和神经退行性疾病等神经元死亡的重要机制。大量的研究证据也表明，多种原因所致的过度释放的谷氨酸，可通过其相关受体介导的兴奋性神经毒作用，导致黑质纹状体DA能神经元变性或坏死。分布于星形胶质细胞的高亲和力谷氨酸转运体对谷氨酸的再摄取，是谷氨酸递质灭活的主要途径。再摄取功能障碍无疑能加重谷氨酸及其受体介导的兴奋性神经毒作用，导致神经退行性病变的发生与发展。由此推测，鱼藤酮对黑质纹状体多巴胺神经元选择性毒性作用，可能与其破坏星形胶质细胞的谷氨酸转运系统功能有某种关系。为此，本实验围绕谷氨酸代谢相关酶类及其转运体进行了深入研究，以寻找鱼藤酮多巴胺能神经元选择性毒性作用机制，藉以为PD等神经退变性疾病的防治研究提供新的思路。 方法：1：鱼藤酮大鼠PD损伤模型：建立SD大鼠皮下注射鱼藤酮与Alzet微泵恒流给药两种模型，染毒时间为28 d。利用光镜和免疫组织化学方法观察大鼠纹状体病理损伤、神经元变性改变以及星形胶质细胞增生反应；HPLC与同位素标记法检测纹状体胞外谷氨酸浓度和突触体谷氨酸转运能力；RT-PCR、Western Blot及生化分析测定GLAST，GLT-1，GS基因表达和蛋白活性。2：离体星形胶质细胞鱼藤酮染毒模型：观察鱼藤酮对星形胶质细胞的毒性作用；RT-PcR、Western Blot和免疫组织化学检测GLAST，GLT-1，GS基因和蛋白表达；GLT-1特异性抑制剂DHK，GLAST非特异性抑制剂PDC和GS特异性抑制剂MSO对鱼藤酮染毒星形胶质细胞Glu转运的干预作用；钙离子成像分析系统监测星形胶质细胞[Ca<2+>]<,i>动态变化；并探讨CaMK Ⅱ在鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍中的作用。 结论： 1、成功建立了鱼藤酮背部皮下注射和微泵恒流给药两种动物模型。研究发现，鱼藤酮对大鼠纹状体组织具有毒性作用，可使神经元发生形态学改变并发生变性损伤，星形胶质细胞出现增生化反应，后者可能参与了鱼藤酮的神经毒性作用。 2、鱼藤酮显著降低纹状体突触体Glu摄取功能，造成组织间隙Glu浓度明显升高，这可能是鱼藤酮致多巴胺神经元损伤的重要原因之一。 3、鱼藤酮对体外培养的星形胶质细胞具有明显的毒性作用。主要表现为细胞形态发生明显改变，活力降低，胞膜受损，引起细胞活力改变的最小暴露剂量高于引起细胞形态改变的最低剂量，说明体外培养细胞对毒物敏感程度较高，细胞容易脱壁，虽然细胞形态有明显改变，但细胞仍具活力；与神经元PCI2细胞比较，星形胶质细胞对同剂量鱼藤酮染毒的耐受能力更强；此外，染毒细胞增殖分化受到抑制，以Cx43为结构基础的细胞缝隙连接受到明显破坏。 4、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLAST基因表达下调，蛋白活性显著降低，可能是引起鱼藤酮所致Glu摄取功能下降的主要原因之一。 5、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLT-1基因表达增强，蛋白活性显著升高。两种转运体在中毒后出现不同的反应，提示它们的功能活性在胞内可能受不同机制调控，GLT-1表达上调可能是机体对Glu浓度升高作出的代偿性保护反应。 6、鱼藤酮染毒细胞和组织Na<+>/K<+>ATP酶活性随着鱼藤酮浓度的增加而降低。Na<+>/K<+>ATP酶活性的降低一方面使依赖于ATP的GLAST和GLT-1转运功能障碍，影响谷氨酸摄取和转运，造成中枢神经元的兴奋性损伤；另一方面可导致离子交换功能障碍，引发细胞内Ca<2+>超载。 7、鱼藤酮染毒细胞和组织GS基因和活性表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加。此变化有助于加快突触间隙Glu合成为谷氨酰胺(Gln)，可能是星形胶质细胞为保护神经元作出的反应。 8、在GLT-1特异性抑制剂DHK干预处理组，星形胶质细胞Glu转运能力略有下降，但与单纯鱼藤酮中毒组比较无统计学意义。提示GLT-1于此浓度鱼藤酮染毒条件下，在星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低过程中，并非占据主导地位。 9．GLAST非特异性抑制剂PDC干预处理后，星形胶质细胞Glu转运能力下降，与单纯鱼藤酮中毒组比较有显著的统计学意义。提示与GLT-1相比，GLAST的下调是星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低的主要因素。 10．采用谷氨酰胺合成酶特异性抑制剂MSO干预处理后，染毒星形胶质细胞Glu转运能力下降，与单纯鱼藤酮中毒组比较有显著的统计学意义。提示GS亦参与了鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍。 11、鱼藤酮诱导星形胶质细胞[Ca<2+>]<,i>增加，且随着鱼藤酮浓度的增高，[ca<2+>]<,i>增高的趋势更为明显；在无钙缓冲液环境下，可见曲线平缓，峰值下降，峰值时荧光强度增加值△F显著降低；细胞内钙库释放抑制剂TMB-8显著抑制鱼藤酮引起的[Ca<2+>]<,i>升高，但与无钙环境比较，其抑制作用的发生时间稍迟。上述结果提示细胞外钙的内流与细胞内钙的释放均参与了峰值的形成。细胞分别用尼莫地平与MK-801预处理后，[Ca<2+>]<,i>上升变的缓和，△F显著降低。但无论是峰值还是观察结束时的钙水平，MK-801预处理组都未达到尼莫地平预处理组的抑制水平，表明鱼藤酮引起的细胞外钙的内流主要是通过电压门控钙通道进行的。 12、鱼藤酮诱导的胞内钙超载，使CaMKⅡ Thr286发生自身磷酸化，从Ca<2+>依赖形式转变为非Ca<2+>依赖而活化，活性持续存在，而Ca<2+>依赖活性显著下降。KN-62能抑制Glu介导的CaMKⅡ自身磷酸化，从而保护Ca<2+>依赖活性。将星形胶质细胞用KN-62预处理后，发现鱼藤酮中毒后星形胶质细胞谷氨酸摄取功能较单纯中毒组有显著提高，提示CaMKⅡ可能参与了谷氨酸转运体摄取功能的调节。 综上所述，鱼藤酮通过影响星形胶质细胞GluTs的表达及GS活性，增加脑内Glu释放，可能是其发挥神经毒性的重要机制之一。其结果提示：探索在线粒体抑制类农药中毒条件下，如何保护受损的星形胶质细胞(如加入外源性神经保护因子、BDNF等)，进而持续提高GluTs及GS的表达和功能活性，对于保护中枢神经元可能具有重要意义。