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研究目的本研究以中性粒细胞为主体研究对象,分别离体模拟运动时内环境的变化与在体建立大鼠过度训练模型来确定运动激活中性粒细胞NADPH氧化酶的刺激条件,通过分析过度训练引起中性粒细胞过氧化损伤程度及细胞功能变化的关系来揭示过度训练引起的运动性免疫抑制的发生机制。最后以NADPH氧化酶为干预的靶点,通过二联苯碘（DPI）合并谷氨酰胺（Gln）补充干预,进行过度训练引起的运动性免疫抑制防护的方法探讨。研究方法1.取10名健康男性（年龄19-23岁）外周静脉血分为对照组、高温组、低氧组、过氧化氢（H2O2）及乳酸组并同时配对给予DPI处理组,各组分别在不同的高温、低氧、H2O2以及乳酸浓度处理后孵育。流式细胞仪测定全血中性粒细胞呼吸爆发和吞噬功能,分离中性粒细胞测定NADPH氧化酶的活性。建立吞噬细胞NADPH氧化酶活性的与呼吸爆发的相关回归方程,取吞噬功能最高点的乳酸浓度,再次加入此浓度乳酸处理后,全血分离中性粒细胞,免疫细胞化学结合共聚焦测定NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox的共定位。2. 50只雄性Wistar大鼠随机分为3组,安静组（C）、过度训练组（E）、DPI干预组（D）,E组及D组进行递增负荷跑台训练11周,最后一周训练晨取眼眶静脉采血进行过度训练的指标测试,当指标达过度训练标准后,在末次训练后36h-40h内取血分离中性粒细胞固定做NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox的免疫细胞化学的共定位实验;ELISA方法检测血浆细胞因子及脂质过氧化水平;分别提取中性粒细胞与淋巴细胞,化学发光法测定NADPH氧化酶活性;双氯素细胞内探针测定细胞内ROS;流式AnnexinV/PI双染色法测定细胞凋亡与坏死程度;CCK-8测定细胞增殖能力;单细胞凝胶电泳测定淋巴细胞DNA损伤程度,流式测定全血中性粒细胞呼吸爆发和吞噬功能。3.在上述实验的基础上,取50只雄性Wistar大鼠随机分为5组,增加Gln补充组（G）及DPI合并Gln补充组（DG）,过度训练后取外周静脉血进行血浆细胞因子、脂质过氧化水（MDA）平、中性粒细胞活性标志物（MPO）的测定,分离中性粒细胞做NADPH氧化酶活性测定;Western blot半定量测定gp91phox和p47phox的蛋白表达;流式细胞仪测定中性粒细胞的呼吸爆发和吞噬功能的测定。研究结果1.外周血在高于40℃温度、100uM H2O2处理后中性粒细胞NADPH氧化酶的活性显著升高并伴有呼吸爆发和吞噬功能的同步提高;氧浓度为10%-15%的处理及血乳酸浓度低于4.81mmol/L的处理后NADPH氧化酶的活性显著降低并伴有呼吸爆发和吞噬功能的同步降低,中度浓度（4.81mmol/L～8.14mmol/L）的乳酸浓度处理后中性粒吞噬细胞呼吸爆发依赖乳酸浓度的增加而增加。2. 7.69 mmol/L及以上血乳酸浓度可使NADPH氧化酶关键亚基p47phox移为至质膜与gp91phox出现共定位现象,并引起中性粒细胞呼吸爆发产生过量ROS而导致其吞噬功能的急剧下降;吞噬细胞NADPH氧化酶活性的改变与呼吸爆发的变化高度相关; DPI处理后NADPH氧化酶及呼吸爆发功能与吞噬功能同步下降。3.同安静对照组比较,过度训练后E组血浆IL-1b显著升高,IL-8、TNF-α显著升高（P <0.01,P <0.05）,MCP-1与CINC显著降低（P <0.05）,而D组血浆IL-1b、MCP-1显著下降（P <0.05）,IL-8、TNF-α显著升高（P <0.05）。E组大鼠血浆MDA、MPO及NDPH氧化酶活性均上升,而D组上述三项指标同步下降。4.同安静对照组比较,过度训练后E组、D组中细胞凋亡的百分比均显著上升（P <0.01）,但中性粒细胞的死亡数E组增加（P <0.05）而D组无显著变化。E组出现DNA损伤的彗星细胞数显著升高（P <0.01）,且彗星细胞的宽度和尾长的变化均达到显著性水平,而D组出现彗星细胞数、彗星细胞的宽度和尾长以及淋巴细胞增殖能力有所增多但均未达到显著性水平。5.过度训练后E组中性粒细胞NADPH氧化酶关键亚基p47phox移为至质膜与gp91phox出现共定位现象。且NADPH氧化酶活性与血浆过氧化水平、中性粒细胞活性、细胞凋亡、淋巴细胞DNA损伤呈高度的正性相关（P <0.01）,而与淋巴细胞增殖能力、中性粒吞噬功能负性相关。6.同安静对照组比较,过度训练后G组血浆浓度除NO显著上升外其余细胞因子的变化基本同E组相同;而DG组中只有NO、CINC浓度显著增加外,其余各组的细胞因子浓度无显著性变化。7.同安静对照组比较,过度训练后E组中性粒细胞的呼吸爆发及吞噬能力均显著降低（p<0.05）,D组与G组两者也有降低但为达到显著性水平。同E组比较,D组、G组的呼吸爆发与吞噬功能有上调的趋势,DG组则两者都显著性上升（p<0.01）。8.过度训练后E组中大鼠中性粒细胞NADPH氧化酶gp91phox和p47phox的表达均显著上调（p<0.01）,除DG组的gp91phox的蛋白表达显著下调（p<0.05）外,其余各组的gp91phox和p47phox蛋白表达均无显著变化;同E组比较,D组、G组及DG组无论是gp91phox还是p47phox的蛋白表达均显著下调（p<0.05）。研究结论1.模拟运动时内环境的变化条件可激活NADPH氧化酶引起中性粒呼吸爆发和吞噬功能发生相应的改变。2. 7.69 mmol/L血乳酸浓度可作为中性粒细胞过氧化应激的敏感刺激浓度,前瞻性评价运动时机体NADPH氧化酶介导产生的ROS的过氧化反应。3.过度训练时血乳酸浓度上升、血浆炎性因子、趋化分子的分泌、中性粒细胞外渗相关的黏附蛋白的表达上调因素等因素可激活中性粒NADPH氧化酶,中性粒细胞中NADPH氧化酶介导产生的ROS是机体内源性ROS产生的主要途径。4.过度训练时其他途径产生的ROS增多以及炎性因子的分泌增多引起NADPH氧化酶介导产生ROS增多而使机体发生过氧化应激的胁迫状态,此为中性粒细胞凋亡甚至死亡、淋巴细胞DNA损伤等过氧化损伤的潜在因素。5.过度训练激活NADPH氧化酶介导产生过量的ROS而引起细胞的过氧化损伤是运动型免疫抑制的细胞免疫减弱的发生机制。6. DPI合并Gln补充,一方面通过降低NADPH氧化酶途径产生的ROS,另一方面通过Gln对细胞的能量调理作用,有效地逆转过度训练引起的中性粒细胞过氧化时损伤导致的细胞功能下降。