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棉花是一种重要的经济作物,具有十分明显的杂种优势。但我国棉花细胞质雄性不育系的研究和利用较晚,棉花杂种优势的利用和基础研究相对滞后。植物雄性不育是杂种优势利用的基础,其产生的机理极其复杂,至今尚未得到完全解析。高等真核生物的组蛋白共价修饰(如乙酰化、甲基化和泛素化)是调控基因表达的重要环节。其中,泛素化修饰作为一种被严格调控的动态可逆过程,与植物的生殖发育密切相关。本研究以棉花细胞质雄性不育系晋A及其同核异质保持系和亚棉A不育系及其同核异质保持系不同发育时期的花蕾为研究材料,克隆组蛋白去泛素化酶GhOTUD5基因,并对其进行表达模式研究,旨在探讨组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与棉花细胞质雄性不育的关系,以期为探究棉花细胞质雄性不育机理奠定基础。结果如下:1、采用同源克隆的方法,克隆获得组蛋白去泛素化酶GhOTUD5基因cDNA及基因组DNA全长序列,并进行生物信息学分析。棉花晋A、亚棉A不育系及其保持系GhOTUD5基因cDNA全长2007bp,存在两个开放阅读框,其主效开放阅读框(mORF)长1635bp,编码544aa;上游保守肽开放阅读框(CPuORFs)长141bp,编码46aa。基因组DNA全长分别为6166bp、6165bp、6158bp,均由8个外显子和7个内含子组成。经生物信息学聚类分析发现,GhOTUD5基因的mORF蛋白与人类HsOTUD5蛋白、拟南芥OTLD1蛋白、水稻Os04g0414100基因编码的蛋白质为直系同源物;上游保守肽序列(CPuORFs)属于uORFs同源组多肽HG31;蛋白多序列比对分析发现OTUD5蛋白的保守性一般,仅在保守结构域内相对保守:ChOTUD5基因上游启动子序列分析表明,GhOTUD5基因表达受光响应与茉莉酸甲酯、赤霉素等生物激素调节。2、经多次重复克隆实验,在晋A不育系中鉴定出3种的GhOTUD5基因突变类型,分别为SNP单碱基突变型、片段缺失突变型和片段插入突变型。3种突变型分别编码236aa、214aa和348aa,突变均导致了 GhOTUD5蛋白的保守结构域缺失或不完整。3、对棉花晋A、亚棉A不育系及其保持系小孢子发育不同时期的花蕾进行GhOTUD5基因表达量测定,结果表明:晋A不育系中GhOTUD5基因在小孢子败育过程中极显著下调表达,而同时期晋A不育系与保持系叶片中的GhOTUD5基因表达量基本相同。亚棉A不育系中GhOTUD5基因在小孢子败育前显著高于保持系,而败育时期、败育后的花蕾以及叶片中表达量基本相同。由此说明:GhOTUD5基因仅在花蕾中差异表达,与小孢子的育性相关;并且不同类型不育系GhOTUD5基因表达模式不同。4、构建GhOTUD5基因亚细胞定位载体,利用烟草叶肉细胞瞬时表达,观察到GhOTUD5蛋白被主要定位于细胞核与细胞膜。推测其作为去泛素化蛋白酶不仅靶向组蛋白,有可能对膜脂蛋白同样具有去泛素化的功能。5、构建GhOTUD5基因功能表达载体,并利用农杆菌介导的花序侵染法转染拟南芥,为后续GhOTUD5基因功能获得性突变体表观遗传学实验奠定基础。