论文部分内容阅读
大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是一种重要的食源性致病菌,在世界范围内造成了严重的公众健康危害,是肠出血性大肠杆菌中研究最多的血清型。传统的大肠杆菌O157:H7检测方法在检测时间、灵敏度和特异性上均存在一定的缺陷,不能满足日益严格的检测需要,因此开发快速、灵敏、经济的大肠杆菌O157:H7检测分析方法非常重要。适配体是一段能与靶标特异性结合的单链DNA（ssDNA）或RNA分子,具有高亲和性、高特异性、靶标范围广等特点。铜基金属有机骨架（Cu-MOF）作为一种新型的纳米多孔材料,具有孔隙率、比表面积大的特点以及生物相容性、仿生催化性等特殊性质,已被应用于医药、化工、食品等多个领域。本研究在筛选大肠杆菌O157:H7的适配体的基础上,利用Cu-MOF具有过氧化物酶的催化特性,将其与适配体结合用于大肠杆菌O157:H7的检测。主要工作内容如下:首先,利用Cell-SELEX技术筛选获得大肠杆菌O157:H7的适配体。本实验以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7（调整期,对数期和稳定期）作为正向筛选靶标,以福氏痢疾杆菌、产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为反向筛选菌种,先将ssDNA文库与靶标孵育,然后离心分离未与靶标结合的ssDNA文库,再将与靶标结合的文库解离下来,经过聚合酶链式反应（PCR）,最后酶切制备DNA单链。经过11轮正向筛选和3轮反向筛选,逐渐富集与不同生长时期的大肠杆菌O157:H7结合良好的ssDNA次级文库,并将第14轮的PCR产物进行克隆测序。其次,进行适配体与靶标亲和性和特异性验证及其结合机理的初步研究。将克隆测序获得的32条寡核苷酸序列进行分析,按照其同源性和二级结构将这32条序列分成九个家族,每个家族中挑选出一条具有代表性的序列对其进行亲和性和特异性分析。通过流式细胞技术分析得出亲和力最高、特异性最强的两条能结合不同生长时期大肠杆菌O157:H7适配体（Apt-4,Apt-5）,其与大肠杆菌O157:H7的结合荧光强度分别高达76.94%和77.29%,Kd值分别为9.04±2.08 nmol/L、15.13±0.88 nmol/L。接着通过用蛋白酶K和胰蛋白酶处理大肠杆菌O157:H7后与羧基荧光素（FAM）标记的适配体孵育测定荧光强度,发现经蛋白酶处理之后的大肠杆菌O157:H7与适配体的结合荧光强度并未下降反而略有上升,证明结合位点不是细菌表面膜蛋白质。最后,构建一种基于适配体识别-过氧化物模拟酶Cu-MOF可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法。将适配体Apt-5固定于酶标板上作为捕获探针,适配体Apt-4与Cu-MOF相连作为信号探针,当体系中有靶标存在时,适配体与靶标结合,形成适配体-靶标-适配体修饰的Cu-MOF夹心结构,再加入TMB-H2O2溶液显色于450 nm处测量吸光度值。结果表明,大肠杆菌O157:H7在424.2×106 cfu/m L范围内与450 nm处吸光度值具有良好的线性关系,线性回归方程为y=0.12089x+0.01176（R2=0.99414）,最低检测限为31 cfu/mL。将该方法用于实际牛奶样品进行检测,结果与平板计数法的检测结果无显著差异,表明该方法实用和可靠。