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氧化刺激可引起脑微血管内皮细胞凋亡,造成血脑屏障功能紊乱甚至丧失,导致中枢神经系统暴露,脑部疾病发生。由于天然提取的抗氧化剂容易被酶降解,而人工合成的有机抗氧化剂可选择的类型和在血流中的稳定性也有限,因此近年来,稳定性好、效应持久的纳米抗氧化颗粒渐受重视。本论文选择了C60(C(COOH)2)2,C60(OH)22和Gd@C82(OH)22三种功能化富勒烯衍生物作为抗氧化材料,通过建立大鼠脑微血管内皮细胞(rCMECs)的离体血脑屏障模型,全面、系统、深入的研究了富勒烯衍生物对氧化损伤的血脑屏障细胞具有保护效应。
首先,作者采用若干表征方法对三种富勒烯衍生物进行了表征,观察到它们在生理溶液中是以球状团聚体的形式存在,且粒径大小存在差别。
接下来,作者发现C60(C(COOH)2)2不能进入正常培养状态下的rCMECs细胞,且不影响rCMECs细胞的增殖和生理功能。有趣的是,在用H2O2对rCMECs细胞进行氧化损伤后,发现C60(C(COOH)2)2能够大量进入rCMECs细胞中,并明显抑制细胞凋亡、消除线粒体肿胀、抑制细胞骨架解聚,消除胞内活性氧(ROS)。这是首次发现C60(C(COOH)2)2对损伤的血脑屏障细胞表现出一种选择性进入、并发挥保护作用的积极效应。进一步用免疫印迹法(Westem-blot)检测MAPK信号通路的各组成蛋白,发现C60(C(COOH)2)2加入后,能够抑制胞内JNK-c-Jun-cyt c-caspase-3-PARP凋亡通路的活化,第一次系统地从分子机制上阐明了C60(C(COOH)2)2的抗氧化机理。
随后,用C60(C(COOH)2)2和C60(OH)22孵育NO损伤的rCMECs,同样观察到它们对细胞活性、细胞形态和细胞骨架的保护作用,以及对胞内ROS的抑制作用。这个结果证实了功能化富勒烯衍生物对氮、氧自由基引起的细胞损伤均有保护效果,进一步丰富了富勒烯衍生物对自由基损伤保护效应的研究。
最后,通过用C60(C(COOH)2)2,C60(OH)22和Gd@C82(OH)22孵育H2O2损伤的rCMECs细胞和人肺腺癌细胞(A549),并在体外用电子自旋共振技术(ESR)检测三种富勒烯衍生物对生理常见自由基的清除作用,发现三种富勒烯衍生物对所有类型的自由基均有清除作用,也能有效抑制氧化损伤造成的细胞活性降低和线粒体膜电位下降。然而,三种富勒烯衍生物的细胞保护效果存在显著差别,其作用强弱与它们清除自由基的能力高度相关,顺序依次为:Gd@C82(OH)22>C60(OH)22> C60(C(COOH)2)2。这是首次在体外和细胞模型上,发现不同类型富勒烯衍生物对不同自由基类型的清除作用和它们对细胞的保护作用存在差别,提示了富勒烯衍生物的尺寸、表面化学基团修饰与其抗氧化作用密切相关。