第一部分:氧化石墨烯介导的低温光热治疗对骨肉瘤的抑制和治疗效果背景:传统的肿瘤的治疗方法如外科手术治疗,放疗,化疗等,虽然可以达到肿瘤的杀伤作用,但其具有的诸多副作用受到越来越多的关注,如治疗效果不佳,术后容易复发转移,患者要承受巨大的生理疼痛,经济负担等。这些问题都促使着科研工作者向更多的领域进行开发和创新,以期找到更好的治疗方案,光热治疗作为一种新兴的肿瘤治疗方案,受到广泛关注,但光热治疗存在对正常组织的热损害的问题,开发新的光热材料,既可以保证对肿瘤细胞的杀伤效应,又可以保护机体的正常组织,是本研究的重点。方法:通过酰胺键连接石墨烯（GO）与叶酸（FA）,通过大π键的吸附作用连接GO-FA与HSP90特异性抑制剂SNX2112,傅里叶红外成像及透射电子显微镜的元素分析对材料表征进行检测;动物血清提取检测血液肝肾功能和解剖重要脏器形态确定材料生物毒性;808nm红外光热及近红外热成像仪检测材料的光热特性;CCK8实验及凋亡检测证实材料的抗肿瘤特性;体内实验通过皮下成瘤进行,小动物活体成像检测肿瘤靶向性,肿瘤大体观及免疫组化染色检测材料对肿瘤的体内作用;结果:傅里叶红外成像及透射电子显微镜的元素分析证实了材料制备完整,SNX-2112载药率约20%;在808nm近红外光照条件下进行光热90s,通过红外热成像仪可以证实材料具备良好的光热效果,温度可稳定达到43-45℃;在尾静脉注射该材料2个月后对血清肝肾功能及重要脏器形态进行检测,证实体内注射该材料对机体无明显毒副作用;体外细胞实验证实,该材料在温度达到43-45℃的条件下,与骨肉瘤细胞系HOS共培养,肿瘤细胞将达到70-80%的凋亡率,皮下成瘤实验证实该材料具有显著的靶向性,富集于肿瘤并在近红外光热条件下发挥肿瘤灭活的作用;结论:低温光热材料GO-FA-SNX2112成功制备,可以在相对低温情况下（43~45℃）达到肿瘤杀伤的作用,同时相对低温可以保护机体的正常组织,将来可能存在临床应用的价值。第二部分:氧化石墨烯介导的低温光热治疗对骨肉瘤的抑制和治疗效果的机制探索背景:肿瘤的辅助治疗方式如光热疗法也存在诸多问题,如对正常组织的热破坏作用,其诱导肿瘤细胞死亡的机制尚不明朗,肿瘤细胞死亡后机体所发生的全身免疫反应尚未被深入研究等,这些都是在光热疗法应用于临床之前必须解决的问题。探索低温光热治疗过程中肿瘤细胞所发生的生理病理变化,阐明低温光热治疗过程中肿瘤细胞的死亡方式,死亡机制和死亡途径,是本研究的重点。方法:通过western及PCR实验验证肿瘤细胞内通路的改变情况,免疫荧光证实细胞内自噬水平的改变,回复实验的设计中,通过AKT通路的激活剂胰岛素和抑制剂LY294002来证实AKT通路在肿瘤细胞死亡过程中的作用,通过自噬通路的激活机3-MA和抑制剂雷帕霉素来证实自噬在肿瘤细胞死亡过程中的作用,以上正向和反向回复实验来证实低温光热治疗过程中肿瘤细胞死亡的通路及关键分子;结果:通过反向回复实验我们发现AKT通路的激活剂胰岛素可以挽救低温光热治疗引发的自噬的过度激活,肿瘤细胞的死亡和PDL1表达的下降,自噬通路的抑制剂3-MA可以挽救低温光热治疗引发的肿瘤细胞的死亡和PDL1表达的下降,正向回复实验我们发现AKT通路的抑制剂LY294002可以强化低温光热治疗引发的自噬的过度激活,肿瘤细胞的死亡和PDL1表达的下降,自噬通路的激活剂雷帕霉素可以强化低温光热治疗引发的肿瘤细胞的死亡和PDL1表达的下降。另外,发现与经过光热治疗的肿瘤细胞共培养后,免疫细胞T细胞出现了激活,表现为活化的表面标志CD69表达量增加,而抑制型表面标志PD1,TIM-3和LAG-3表达下降。结论:该材料对肿瘤的杀伤作用来自于两个方面,一是细胞自身的自噬过度激活,成为死亡因素,二是细胞表面免疫检查点分子表达的改变,诱导自身免疫反应的增加,并逆转了肿瘤微环境的冷免疫情况,从而促进了肿瘤的杀伤作用。第三部分:氧化石墨烯介导的低温光热治疗的免疫学效应背景:低温光热疗法是一种非侵入性的治疗方案,可以相对快速地达到肿瘤的杀伤和消融的作用并且具有相对较少的副作用,但是低温光热治疗过程中机体的全身免疫改变并未有研究深入探索,而阐明机体的免疫反应对低温光热治疗的临床应用具有重要意义,因此探索氧化石墨烯介导的低温光热治疗中机体的免疫系统改变,是本研究的重点。方法:将光热治疗后的肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞共培养,通过迁移实验,划痕实验和迁移相关基因的PCR检测来证实肿瘤细胞的迁移能力,通过CCK8实验检测肿瘤细胞的增殖能力,将光热治疗后的肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞按一定比例注射入裸鼠皮下,通过皮下成瘤实验来检测肿瘤相关巨噬细胞在体内对肿瘤的抑制情况。对于肿瘤相关巨噬细胞,低温光热治疗后通过PCR检测和流式检测对体其极化方向进行检测,以确定光热治疗对其极化的影响。结果:在43-45℃低温光热治疗后,肿瘤相关巨噬细胞的M2极化受到抑制,其上清可以抑制肿瘤细胞的增殖,这通过CCK8增殖实验证实,经过低温光热治疗的肿瘤相关巨噬细胞上清还可以抑制肿瘤细胞的迁移,这通过划痕实验,transwell实验和迁移相关基因的PCR结果证实,在体内,低温光热处理的肿瘤相关巨噬细胞可以抑制体内肿瘤组织的生长。结论:低温光热治疗可以通过抑制肿瘤相关巨噬细胞M2的极化来达到抑制肿瘤细胞增殖迁移的作用。第四部分:基因改造的大肠杆菌负载p DA/Ce6实现骨肉瘤强化光动力和光热联合治疗策略背景:单纯的低温光热治疗虽然可以达到良好的肿瘤杀伤和抑制效果,但仍不足以替代传统的治疗方法,这与单一的治疗方式杀伤效力不够有关。前期的实验研究已经证实光热治疗可以激发机体的抗肿瘤免疫,因此充分利用机体的免疫激活,将光热治疗和光动力治疗,免疫治疗相结合,可能达到极佳的肿瘤治疗效果。充分利用机体的抗肿瘤免疫,开发光热/光动力治疗/免疫治疗的联合治疗策略,是本研究的重点。方法:由于多巴胺粒子的表面电荷与大肠杆菌表面电荷互相吸引,因此可以通过吸附形成新型生物材料,通过扫描电镜和透射电镜成像及材料合成过程中的电位改变证实材料合成过程,通过细菌的估计培养基涂布实验证实细菌的生物活性,通过目的蛋白的免疫印迹电泳证实大肠杆菌基因改造成功并具有功能,CCK8实验及凋亡检测证实材料的抗肿瘤特性,体内实验通过皮下成瘤进行,小动物活体成像检测肿瘤靶向性,通过肿瘤大体形态观察及免疫组化染色来检测材料在体内对肿瘤的作用。结果:在联合治疗策略中,扫描电镜的形态证实p DA/Ce6纳米粒子均匀负载于大肠杆菌表面,形成了具有生物活性的新型材料,抗生素筛选证实大肠杆菌的质粒转化成功,另外通过琼脂糖固体细菌培养基对大肠杆菌的培养,证实p DA/Ce6纳米粒子的负载不影响大肠杆菌的增殖和靶向能力,大肠杆菌具有负载p DA/Ce6纳米粒子的功能,靶向肿瘤缺氧区域的功能,表达人过氧化氢酶并增强光动力治疗的功能,此光热治疗/光动力治疗/生物治疗的联合治疗策略,可以达到良好的肿瘤抑制效果,是之前光热治疗的延伸和发展,有望在将来应用于临床。结论:通过基因改造的大肠杆菌开发了一种新的光热治疗/强化光动力治疗/生物治疗的联合治疗策略,可以达到强大的肿瘤杀伤和抑制效果,这种新的肿瘤的光疗和联合治疗的新概念和新方法,存在广阔的临床应用潜能。