miRNA前体结构对其加工和功能的影响及在蔬菜抗病中的潜在应用

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在植物体内,microRNAs(miRNAs)是一类长度为20-24 nt的非编码小RNA,在植物的生长发育、生物和非生物胁迫等方面有着非常重要的作用。miRNA的生成主要依赖DCL1,而DCL1的结构决定了miRNA的长度主要为21 nt;但是当miRNA/miRNA*的miRNA链上有一个不对称凸起时,能使miRNA的长度由21 nt变成22 nt,这种改变能触发靶基因产生tasiRNA,对植物的生长发育很重要。在miRNA生成过程中miRNA/miRNA*会与很多蛋白互作,如DCL1、HEN1、HASTY和AGO等。前人研究表明miRNA/miRNA*上的不对称凸起能伸出RNA双螺旋的表面,如果凸起伸出的地方位于RNA与蛋白的互作位点,则可能干扰miRNA/miRNA*与蛋白的互作,本论文旨在探究miRNA/miRNA*中不对称凸起的位置对miRNA生成和功能的影响,并探究其在蔬菜抗病毒中的应用。为此,本研究构建了一系列在miRNA/miRNA*的不同位置上含有不对称凸起的amiRNA(artificial miRNA),通过本氏烟草瞬时表达实验探究不对称凸起的位置对miRNA生成及功能的影响,主要结果如下:(1)当miRNA链上有一个不对称凸起时,生成的miRNA长度均为22 nt,即不对称凸起的位置不影响miRNA的长度;但是会影响miRNA的丰度,当凸起位于miRNA两端或者中间时丰度较低。(2)miRNA链的不同位置对不对称凸起大小的忍耐性不同,当凸起位于miRNA的第14个碱基后面时,可以忍耐3个连续不对称凸起,且每增加1个凸起miRNA的长度增加1 nt。(3)当miRNA*链上有一个不对称凸起时,其位置能同时影响miRNA的长度和丰度。(4)改变miRNA*链上的凸起位置,能使miRNA的长度小于21 nt,导致其不能高效触发tasiRNA生成。(5)构建依赖DCL1且5′为A的人工miRNA能与AGO4结合并介导靶位点附近DNA甲基化。(6)在miRNA/miRNA*中的特定位置引入不对称凸起,能使miRNA/miRNA*逃离与P19的结合,提高amiRNA抵抗番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)的能力,该结果为提高amiRNA的抗病毒效率提供了新的思路。本研究深化了人们对miRNA和tasiRNA生成的了解,对设计高效表达和高沉默效率的amiRNA有着重要的指导意义。
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