论文部分内容阅读
酪蛋白是生物活性肽的重要来源之一。本研究采用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解物，并在乙醇-水介质中对酪蛋白水解物进行类蛋白反应修饰，评估类蛋白反应修饰产物的ACE抑制活性、金属离子螯合能力及抑制碳酸钙沉淀能力；同时，对具有最高ACE抑制活性及最大类蛋白合成量的修饰产物进行溶剂分级，研究分级处理对修饰产物ACE抑制活性的影响；最后，模拟体外消化，分析ACE抑制活性最高和类蛋白合成量最大的修饰产物及其分级产物的酶抗性。所得到的研究结果如下：（1）酪蛋白水解物的制备条件为：水解时间6h时，水解物的ACE抑制活性最高，此时水解度为11.6%，相应的IC50=42.8μg/mL。（2）采用响应面分析法，优化得到碱性蛋白酶催化下乙醇-水介质中酪蛋白水解物类蛋白反应修饰的适宜条件为：反应时间固定为6h，乙醇浓度56.8%（v/v）、底物浓度56.8%（w/v）、酶添加量8.36kU/g蛋白质、反应温度37.5℃。如果选择木瓜蛋白酶作为类蛋白反应催化用酶，则固定反应时间6h、底物浓度50%（w/v），单因素试验优化得到最适条件为：乙醇浓度70%（v/v），酶添加量3kU/g蛋白质，反应温度40℃。（3）在优化条件下制备不同类蛋白反应程度的修饰产物，对其ACE抑制活性的测定可知，碱性蛋白酶修饰产物4（TCH4）与木瓜蛋白酶修饰产物1（MCH1）显示出最大的ACE抑制活性，分别为62.5%和64.5%；而碱性蛋白酶修饰产物8（TCH8）与木瓜蛋白酶修饰产物8（MCH8）则显示出最大的类蛋白合成程度，但活性较低，分别为35.6%和41.7%。ACE抑制动力学研究表明酪蛋白水解物、TCH4、TCH8及TCH11均为ACE的竞争性抑制剂。（4）对酪蛋白水解物及碱性蛋白酶修饰产物的金属离子螯合能力测定结果可知，修饰产物的锌离子及钙离子螯合能力均低于酪蛋白水解物，亚铁离子螯合能力略高于水解物，表明乙醇-水相类蛋白反应不利于酪蛋白水解物金属离子螯合能力的提高。酪蛋白水解物及碱性蛋白酶修饰产物对ACE的抑制作用并非由其对锌离子的螯合引起，但抑制碳酸钙沉淀能力则可归于其对钙离子的螯合作用。（5）采用水及体积比为3:7、7:3的乙醇-水溶剂对TCH4和TCH8分级，发现分级处理对它们的ACE抑制活性有影响。分级溶剂中乙醇浓度的增加，使分级产物上清部分的ACE抑制活性增加，沉淀部分则相反。7:3（v/v）乙醇-水溶剂分级的上清部分的活性明显高于修饰产物，并且从TCH4得到的上清部分活性最高（69.5%）。即低极性有机溶剂（7:3，v/v）有利于从修饰产物中分离出具有较高ACE抑制活性的肽组分。（6）对修饰产物及分级产物的进一步水解可知，所得的64个消化产物中有62个的ACE抑制活性为45.1-74.8%，均高于酪蛋白水解物（44.4%），表明乙醇-水相介质中的类蛋白反应修饰可以提高酪蛋白水解物的酶抗性。