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目的：
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)包括原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤是原发性损伤后出现的一系列病理改变,其发病机制极其复杂,脊髓中的神经元再生非常有限,脊髓损伤常导致诸如截瘫、四肢瘫痪等严重的功能障碍[1,2]。其中,缺血再灌注损伤是造成神经损伤的一个重要因素。脊髓缺血再灌注损伤的具体机制尚不清楚,氧自由基介导的脂质过氧化反应、钙离子超载、兴奋性氨基酸、前列腺素等因素在脊髓损伤机制中起重要的作用己得到公认[3-5]。通过转基因技术,使含神经营养基因的细胞分泌神经营养素,促进神经功能恢复成为近期研究的热点[6,7]。
脑源性神经营养因子(brainderivedneurophicfactor,BDNF)是一种重要的神经营养因子,可改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生、减少神经元凋亡[8]。本课题组前期研究发现干细胞移植能改变脊髓内微环境,并使BDNF表达增多,但内源性BDNF的表达不足以修复脊髓损伤。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BHSCs)的来源广泛,易于获取并在体外扩增,可以获得足够数量的细胞用于细胞治疗[9-11]。不仅易于外源基因的转染和表达,而且转染外源基因并不影响BMSCs多向分化能力和体外增殖能力,因此,BMSCs可以作为一种新型的基因治疗的靶细胞。由于所携带的外源基因可表达部分调控损伤部位微环境的神经因子,从而促进BHSCs向神经元和少突胶质细胞分化[12]。绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)不影响细胞的活性或功能,已被广泛用于监测活组织及固定后组织的基因表达、蛋白定位及移植细胞的示踪[13,14]。国内外研究者成功构建了BDNF-GFP质粒并在BMSCs中表达,既能促进神经元的生长,又能进行很好的示踪,有很好的应用前景[15-47]。
本实验拟构建BDNF-GFP真核表达载体,并在BMSCs中表达,然后将BDNF-GFP转染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,检测其对脊髓损伤的修复效果并探讨可能的相关机制。
方法：
一、大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定
1.应用贴壁培养法培养大鼠BMSCs。
2.绘制第三代BMSCs的生长曲线。
3.应用流式细胞仪检测大鼠第3代BMSCs的表面标志物CD34、CD44、CD90。
二、构建BDNF-GFP真核表达载体,检测BDNF在BMSCs中表达
1.扩增提纯重组质粒pEGFP-N1-BDNF。
2.对构建的pEGFP-N1-BDNF重组质粒进行HindⅢ/KpnⅠ双酶切鉴定。
3.RT-PcR鉴定pEGFP-NI-BDNF转染的BMSCs中BDNF的mRNA转录;应用ELISA方法和Westernblotting检测经pEGFP-N1-BDNF转染后BMSCs的BDNF表达情况。
三、观察BDNF-GFP转染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型后对脊髓损伤后神经功能修复情况
1.建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,实验分组。
2.后肢运动评分。
3.各组大鼠术后1w脊髓HE染色。
4.免疫组化检测各组大鼠术后1w脊髓BDNF表达。
5.免疫组化检测各组大鼠不同时间点脊髓caspase-3免疫组化阳性细胞计数情况。
结果：
一、成功分离、培养并鉴定大鼠BMSCs
1.原代和传代培养大鼠BMSCs贴壁生长良好,形态为较一致的长梭形、纺锤形。10-14d时集落边缘汇合,细胞呈较均一的旋涡状或螺旋状分布。
2.体外分离培养的BMSCs能够较好的扩增,与其他细胞相同,均经历了潜伏适应期、对数生长期和生长平台期。
3.应用流式细胞仪检测大鼠第3代BMSCs的表面标志物CD34阴性,阳性率为0.97%;CD44阳性,阳性率为97.57%;CD90阳性,阳性率为98.98%。
二、成功构建BDNF-GFP真核表达载体,BDNF在BMSCs中可以表达
1.重组质粒pEGFP-N1-BDNF扩增提纯成功。
2.对构建的pEGFP-N1-BDNF重组质粒进行HindⅢ/KpnⅠ双酶切鉴定,电泳结果显示长约4.7kb和775bp的两个条带,一条与pEGFP-N载体序列(约4.7kb)接近,另一条与BDNF目的基因序列(775bp)吻合。
3.RT-PCR鉴定证实pEGFP-N1-BDNF转染的BMSCs中存在BDNF的mRNA转录;应用ELISA方法和Westernblotting检测经pEGFP-N1-BDNF转染后BMSCs的BDNF表达量明显高于对照组。
三、BDNF-GFP转染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,可明显改善脊髓损伤后神经功能恢复
1.成功建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。
2.(BDNF+BMSCs)组大鼠缺血再灌注后24h出现后肢瘫痪症状,在72h和1w时,Tarlov评分显著增高,瘫痪明显改善,后肢不仅可支持体重,甚至可以蹒跚行走或行走接近正常,与模型组大鼠比较,差异有显著性意义(p＜0.01)。
3.移植BDNF+BMSCs组大鼠术后1w脊髓HE染色未见空泡形成,细胞核存在,核仁及尼氏体清晰可见,与模型组比较脊髓损伤明显减轻。
4.移植BDNF+BMSCs组大鼠术后1w脊髓细胞胞浆内有较多棕色颗粒,与模型组和移植BMSCs组比较BDNF表达量明显增多。
5.移植BDNF+BMSCs组大鼠缺血再灌注后24hcaspase-3免疫组化阳性细胞计数达最高峰,随时间延长,阳性细胞计数逐渐下降;在同一个时间点,(BDNF+BMSCs)组大鼠caspase-3免疫组化阳性细胞计数与模型组和BMSCs移植组大鼠比较,均为最低,差异有显著性意义(p＜0.01)。
结论：
1.贴壁法体外培养大鼠BMSCs操作简便,细胞增殖能力强,可作为脊髓损伤基因治疗的种子细胞。
2.构建的即NF-GFP真核表达载体转染BMSCs后可大量表达BDNF。
3.BDNF-GFP转染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,可明显改善脊髓损伤后神经功能,比单纯应用BMSCs更能促进大鼠脊髓缺血再灌注损伤修复。