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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种引起仔猪呕吐、腹泻、脱水甚至死亡的肠道α冠状病毒。PEDV变异毒株（GⅡ）自2010年在我国出现,迅速传播至美洲、欧洲和亚洲等多个国家,其发病率和死亡率高,已成为养猪业危害最大的病毒之一。现有的猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）疫苗无法诱导足够的保护性免疫来抵抗PEDV流行毒株的感染,且临床上缺乏有效的抗PEDV药物,导致PED仍在大规模爆发并频繁复发。同时,PEDV常与猪轮状病毒（Porcine rotavirus,Po RV）等肠道病毒混合感染,导致仔猪腹泻程度加重和死亡率增加,给养猪业带来了巨大的经济损失。因此,抗PEDV新型疫苗的研发和有效药物的发现迫在眉睫。反向遗传学可应用于病毒蛋白功能的研究、毒力因子的鉴定、新型疫苗的研发和抗病毒药物的筛选等多个方面。本研究成功建立了PEDV反向遗传操作系统,通过构建携带Nano荧光素酶（Nano Luciferase,Nano Luc,NLuc）基因的重组报告病毒验证该系统的可操作性和稳定性。应用PEDV反向遗传操作系统和动物感染试验发现非结构蛋白1（non-structural protein 1,nsp1）在PEDV致病性中发挥了重要作用。基于此,本研究以PEDV传代致弱毒株YN150为骨架,缺失nsp1关键结构域的同时将YN150的开放式阅读框3（Open reading frame 3,ORF3）基因替换为Po RV VP7基因,构建了nsp1缺失且能表达Po RV VP7蛋白的基因工程疫苗毒株r YN150-nsp1ΔC/ORF3--Po RV-VP7,并在仔猪体内对重组病毒进行免疫评估。同时,应用PEDV重组报告病毒对天然产物库进行了抗病毒药物的高通量筛选（High-throughput screening,HTS）,从803种天然产物中鉴定出25种能显著抑制PEDV增殖的产物,并探究了其中7种抗氧化药物抑制PEDV复制的作用机制。本研究为猪病毒性腹泻的防控提供理论依据和新型疫苗,主要内容如下:1.构建和验证PEDV YN株感染性克隆平台首先,对PEDV变异毒株YN株的第150代病毒（YN150）进行测序以确定全基因序列。再将病毒全基因组分成F1（6055 bp）、F2（3825 bp）、F3（5000 bp）、F4（4336 bp）、F5（4281 bp）和F6（4531 bp）六个连续片段进行分段克隆。通过体外连接获得病毒全长c DNA,经体外转录后电转进入Vero细胞。细胞病变观察、病毒全基因组测序和间接免疫荧光试验（Immunofluorescence assay,IFA）等试验证明PEDV YN150毒株拯救成功。本研究建立了PEDV的反向遗传操作系统,为PEDV的研究提供了有力工具和技术平台。为证明该系统的可操作性和稳定性,我们将PEDV YN150基因组全长c DNA中的病毒复制非必需基因ORF3替换成NLuc基因,构建了重组病毒r YN150-NLuc。蚀斑试验和生长动力学试验发现,r YN150-NLuc感染Vero细胞后产生的蚀斑大小、病毒滴度和生长曲线等生物学特性与其亲本毒株相似。试验结果显示外源基因NLuc在重组病毒r YN150-NLuc基因组中有效表达,同时病毒感染细胞中的NLuc荧光素酶活性与病毒滴度呈正相关。另外,r YN150-NLuc感染后4 h即可检测到荧光素酶基因的表达,而TCID50试验最早在感染后8 h检测到病毒的增殖,说明通过测定荧光素酶活性直接测定病毒滴度,比TCID50试验更加敏感,表明报告病毒r YN150-NLuc可作为指示病毒来高通量筛选抗PEDV药物。应用该反向遗传系统能构建稳定遗传和表达的PEDV重组病毒。2.PEDV nsp1蛋白影响病毒复制和致病力研究nsp1是PEDV重要的毒力因子,它通过抑制宿主基因的表达调控宿主的天然免疫反应。然而,nsp1蛋白在PEDV病毒复制和致病性中发挥的作用及其机制尚不明确。本研究采用生物信息学方法分析发现PEDV的nsp1基因有4个重要的结构域,分别为4～17aa（A区域）、38～53aa（B区域）、59～67aa（C区域）和87～107aa（D区域）。利用PEDV反向遗传系统,以YN17为骨架,分别缺失nsp1的4个结构域,构建nsp1突变体。结果成功拯救出缺失C和D结构域的重组病毒。而缺失A和B结构域后病毒不能存活,表明nsp1的A和B结构域与PEDV复制密切相关。体外生物学特性研究和动物试验发现nsp1 D结构域的缺失不影响病毒复制和致病性;而C结构域的缺失后病毒滴度显著降低,感染仔猪肠道组织中的病毒载量以及TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等细胞炎性因子显著减少,仔猪肠道绒毛的病理损伤程度降低,腹泻情况显著减轻,表明nsp1依赖其C区域在病毒复制和致病性中发挥作用。进一步研究发现,nsp1的C结构域是通过抑制病毒感染早期宿主基因（包括IFN-β、IFN-λ3和ISGs等抗病毒基因）的表达,在病毒逃逸天然免疫反应中发挥着重要作用。本研究首次从病毒水平揭示了nsp1在病毒复制、免疫逃逸和致病性中的作用,并确定了其功能域为C结构域,获得了可作为潜在的PED疫苗候选毒株的致弱病毒r YN17-nsp1ΔC。3.表达Po RV VP7蛋白重组PEDV基因工程疫苗毒株构建和免疫原性测定PEDV和Po RV的混合感染是仔猪腹泻的常见病因之一,它导致仔猪腹泻程度加重,对养猪业造成了巨大的经济损失。开发PEDV和Po RV二联疫苗是防控PEDV-Po RV混合感染的有效策略。本研究应用PEDV反向遗传系统,将YN150全长基因组c DNA中的ORF3基因替换成Po RV VP7基因构建重组病毒r YN150-Po RV-VP7,研发PEDV-Po RV的重组弱毒疫苗。r YN150-Po RV-VP7的生物学特性分析表明,重组病毒基因组中的外源基因VP7能稳定传代和有效表达,r YN150-Po RV-VP7的生长动力学与r YN150相似。免疫评估试验发现仔猪接种r YN150-Po RV-VP7后,未出现腹泻、呕吐和脱水等临床症状,并产生了Po RV VP7和PEDV S两种蛋白的特异性Ig G和Ig A抗体,以及Po RV和PEDV的中和抗体,说明r YN150-Po RV-VP7在仔猪体内具有良好的免疫原性和安全性。为进一步提高疫苗的安全性,我们在r YN150-Po RV-VP7的基础上缺失nsp1蛋白的C区域,成功构建了双基因缺失重组病毒r YN150-nsp1ΔC/ORF3--Po RV-VP7。该病毒能够有效表达外源基因Po RV VP7和载体病毒PEDV S蛋白,且其生长趋势和亲本毒株一致。本研究提供了一个具有预防PEDV和Po RV混合感染潜力的新型重组疫苗候选毒株。4.高通量筛选抗PEDV药物应用重组报告病毒r YN150-NLuc,建立了准确、高效的抗PEDV药物的高通量筛选方法。简言之,通过测定药物处理后的荧光素酶活性和细胞存活率,初步筛选出病毒抑制率＞90%且细胞存活率＞80%的药物;再通过剂量依赖试验确定初筛药物的半数病毒抑制浓度(IC50)和半数细胞毒性浓度(CC50),进一步筛选出选择指数（SI）＞10的药物。利用此方法对天然产物库中的803种产物进行了抗病毒活性的高通量筛选,筛选出25种能显著抑制PEDV复制的天然产物,其中原卟啉IX和7-乙基喜树碱的SI值＞80,表现出极好的抗PEDV活性。经TCID50试验确认了这25种天然产物能高效抑制YN150和YN15的复制,使病毒下降1～5个滴度,抑制率均超过了90%,这为PEDV的防控提供了候选药物。分析这25种抗PEDV天然产物潜在的药理活性,发现其中有7种天然产物具有抗氧化活性,即桦木酸、熊果酸、七叶甙原、石胆酸、去甲二氢愈创木酸、咖啡酸苯乙酯和葡萄籽萃取物。通过IFA分析和TCID50试验再次确认这7种抗氧化药物以剂量依赖的方式抑制YN150的复制,且在低剂量（药物浓度为2.5μmol/L）时,抑制率仍大于60%。为探究抗氧化药物抑制PEDV复制的作用机理,测定了PEDV感染后细胞内活性氧(（Reactive oxygen species,ROS）水平。结果表明PEDV感染后通过促进ROS的产生,导致细胞内ROS累积来激活细胞自噬反应,从而促进自身的增殖。而抗氧化药物通过抑制PEDV感染所诱导的ROS的产生降低细胞自噬水平来抑制病毒的复制,为PEDV的药物研发和防治提供新思路。