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目的构建解离素(Disintegrin/DI)和人Ig G1抗体Fc段重组融合基因到p XC17.4/p CDAN3.1(+)表达载体,转染至293真核表达系统,表达并分泌解离素融合蛋白,获得重组解离素,为其生物活性测定、构效关系研究和临床应用奠定基础。方法1表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1(+)-MDF/DDF的构建1)模板合成目的基因(DI):根据本课题组前期分离的天然江浙短尾蝮蛇蛇毒解离素测定的氨基酸序列合成其相应的c DNA序列并在此序列的3’端引入Ig G3Upper Hinge基因序列。Ig G1 Fc:根据NCBI上公布的人Ig G1 Fc基因序列合成其CH2CH3区域。2)引物设计根据两模板基因序列,设计扩增引物,另外设计一对引物,替换解离素c DNA 3’端的Ig G3 Upper Hinge为Ig G1 Hinge。3)融合基因MDF/DDF的获得PCR法扩增DI及Fc段,琼脂糖凝胶电泳回收后,Overlap PCR法将DI和Fc搭桥形成DI-Fc融合基因,从而形成两种类型的融合基因,即DI和Fc段之间为Ig G3 Upper Hinge和Ig G1 Hinge两种类型,我们将两类设计产生的融合基因分别相应称为MDF和DDF;TA克隆至T Vector p MD19(Simple)测序载体,Hind III/Eco RI双酶切和测序鉴定。4)重组表达载体的构建Hind III/Eco R I双酶切T-MDF/T-DDF获得MDF和DDF融合目的基因,克隆至相同两酶切得到的线性表达载体p XC17.4/p CDAN3.1(+),并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑取单克隆双酶切鉴定。2重组解离素的表达及纯化1)脂质体法Lipofectamine 2000预转染四个表达载体至293FT细胞。2)ELISA法测定293FT细胞培养上清中蛋白的表达量,确定最优表达载体。3)PEI法转染293FT细胞,ExpiFectamine293法转染Expi293F悬浮细胞,获得重组融合解离素,并比较两种转染方法蛋白表达量的差异。4)HiTrap MabSelect SuRe Protein A亲和层析纯化细胞培养上清得到重组解离素。3重组解离素纯度鉴定UPLC法检测纯化后得到的重组解离素的纯度及分子量。使用SEC液相色谱柱(4.6mm×150mm,1.7μm,Waters);柱温:30℃;流动相:0.02 M PB+0.15 M Na Cl缓冲液;检测器:TUV检测器;进样量:10μl;流速:0.4m L·min-1;检测波长:280 nm的条件下,检测两融合蛋白的纯度。4重组解离素免疫原性及生物学活性测定1)还原和非还原条件下,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定重组蛋白分子量,Western blot中分别孵育抗人Ig G Fc抗体和抗蝮蛇毒血清,从两方面验证重组解离素的表达。2)ADP诱导的血小板聚集实验检测重组解离素的生物学活性。结果1表达载体的构建1)融合基因MDF/DDF DI基因片段扩增产物大小为349bp(358bp),Fc基因扩增产物大小为644bp(661bp);Overlap PCR将两片段搭桥后,获得MDF/DDF基因扩增产物大小分别为970bp和985bp;克隆至T载体,双酶切和测序鉴定,挑取正确克隆。2)重组表达载体构建重组载体连接成功挑取单克隆后,Hind III/Eco R I双酶有约1kb大小片段切出,从而成功构建重组表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1(+)-MDF/DDF。2重组解离素的表达、纯化及纯度鉴定1)重组解离素融合蛋白的表达各表达载体转染后细胞培养上清中均有融合蛋白表达,以p XC17.4为表达载体:MDF,DDF浓度分别为0.68mg/L,0.97mg/L;以p CDNA3.1为表达载体MDF,DDF的浓度分别为4.3 mg/L,2.3mg/L,因此初步确定用p CDAN3.1(+)-MDF/DDF表达载体批量转染293细胞,以获得重组解离素。2)重组解离素融合蛋白的纯化Hi Trap Mab Select Su Re Protein A亲和层析纯化293细胞培养上清,洗脱蛋白获得单个目标蛋白峰,PEI转染法蛋白产量约2mg/L,Expi Fectamine293F法蛋白产量约45mg/L。3)重组解离素的纯度鉴定UPLC结果显示两重组解离素的出峰时间均在大于180k Da位置,MDF中有少量小分子蛋白存在,表明纯化所得蛋白多聚体占主要部分。3重组解离素融合蛋白分子量、免疫原性及生物学活性测定1)重组解离素融合蛋白分子量和免疫原性鉴定在SDS-PAGE胶中,MDF存在理论条件下所设计的35k Da大小分子量的单体重组解离素,DDF也有少量二聚体融合蛋白,分子量约为70k Da,但MDF也有二聚体出现,且两种设计中多聚体的占绝大多数。Western Blot结果发现抗人Ig G Fc抗体和抗蝮蛇毒血清分别作为一抗孵育均有条带显出,而同型对照Ig G未有条带显出,表明纯化所得蛋白为既有能识别抗蛇毒血清的解离素和也有识别人Ig G抗体Fc段的融合蛋白。2)重组解离素融合蛋白对ADP诱导血小板聚集的影响所获得的重组解离素具有抑制ADP诱导的血小板聚集作用,其抑制效应与重组解离素的剂量成正比。从功能方面提示重组解离素具有天然解离素相似的抗血小板聚集的作用。结论应用基因重组的方法成功构建真核表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1(+)-MDF/DDF,转染293细胞成功表达并分泌出具有抑制ADP诱导的血小板聚集活性的重组解离素融合蛋白,为进一步研究解离素在抗血栓和抑制肿瘤细胞的粘附、迁移和血管生成等生物学功能奠定了基础。