FADD(Fas-associated death domain protein)是一个接头蛋白,其在死亡受体Fas等介导的细胞凋亡通路中具有重要的信号传导作用。此外,FADD在细胞发育进程、胚胎发生及天然免疫等生物学进程中发挥着重要的作用。尽管对于FADD在介导凋亡信号通路中的功能已有了较为详尽的研究,但对于FADD的非凋亡功能的研究还有待于进一步深入。在关于FADD的非凋亡功能研究中,利用基因改造的小鼠模型研究FADD在T淋巴细胞中的功能是一个重要的研究工具。根据构建策略的不同,这些小鼠主要可以分为以下三类:FADD显性失活转基因小鼠(FADD-DN)、FADD-/-/RAG-1-/-嵌合体小鼠和T细胞特异性FADD基因敲除小鼠(Lck/CD4-FADD、Lck/CD4-FADD-EGFP 小鼠)。利用这些模型,对于 FADD在T细胞激活和增殖等方面的理解取得了很大进展,但对于FADD在T细胞发育的影响,一些研究结果相互矛盾。因此,利用多种T细胞特异性FADD基因敲除小鼠进行进一步比较和分析是非常必要的。在T细胞发育早期,胸腺T细胞的分化、增殖和生存受到多个信号通路的精确调控。其中,pre-TCR信号和Notch1信号途径是参与β-selection调控的主要信号。在 T 细胞发育的 DN3(CD4-CD8-CD44-CD25+)至DN4(CD4-CD8-CD44-CD25-)期,Notch1途径通过调控AKT等下游靶点,维持胸腺细胞的正常糖转运功能以确保生存,并与pre-TCR信号介导的增殖和分化功能共同作用,使得DN期胸腺细胞顺利通过β-selection checkpoint,分化为DP(CD4+CD8+)期细胞并进一步向成熟T细胞发育。由于Notch1在T细胞发育早期所起的重要作用,其表达也受到严格调控。在DN3-DN4期间,Notch1的表达明显下调。在这一发育时期Notch1的敲除或过表达都会影响胸腺T细胞的正常发育。在本研究中,利用loxP/Cre重组系统,我们制备了两种T细胞特异性FADD基因敲除小鼠:Lck-FADD小鼠和CD4-FADD小鼠;并以这两种FADD基因敲除小鼠为材料,对FADD在T细胞早期发育过程中的非凋亡功能及其调控机制进行了较为系统的研究。主要的研究内容包括:i)比较了 FADD在不同阶段的缺失对胸腺T细胞总量及其发育的影响。我们的研究表明,始于胸腺T细胞DN2期的FADD缺失严重影响Lck-FADD小鼠胸腺T细胞的发育与分化,其表现为Lck-FADD小鼠胸腺中DN期T细胞比例上调,同时伴随着DP期T细胞比例的明显下降。同时,在深入分析Lck-FADD小鼠胸腺中DN期细胞亚群比例时,我们发现DN3期细胞比例上调,而DN4期细胞比例下降,表明在Lck-FADD小鼠胸腺中DN期细胞的发育在DN3至DN4期受到了严重阻滞。而始于DN3期的FADD缺失则对CD4-FADD小鼠胸腺T细胞发育没有显著影响。这一结果是对基于FADD-DN小鼠和FADD-/-/RAG-1-/-嵌合体小鼠研究结果肯定和补充,同时也提出了 FADD在T细胞早期发育的不同阶段可能具有各自独特功能的新的假设。ii)分析了 FADD功能缺失抑制T细胞早期发育与分化的可能机制。在T细胞发育的早期(DN3期),通过对CD27、iTCRβ、CD69、CD5等标记的检测,结果显示FADD缺失并不影响pre-TCR信号的产生,故Lck-FADD小鼠胸腺T细胞的减少并非由于DN3期细胞无法通过β-selection而造成的。但始于胸腺T细胞DN3期的FADD缺失会导致胸腺T细胞在DN4期的线粒体通路介导的细胞凋亡显著增加,结果表现为Lck-FADD小鼠DN4期细胞数量明显减少,这可能是Lck-FADD KO小鼠胸腺细胞总量急剧减少的重要原因。iii)探索了 FADD调控胸腺T细胞生存的可能的分子信号通路。研究结果显示,在Lck-FADD小鼠胸腺T细胞的DN4期,伴随着FADD的敲除,Notch1及其下游靶基因的表达上调,并可能通过抑制DN4期胸腺T细胞接受pre-TCR信号后AKT的磷酸化来降低糖转运蛋白glut1的表达。另一方面,我们发现在Lck-FADD小鼠胸腺T细胞中Notch1的转录抑制蛋白NKAP表达明显下调,并在MEF及JURKAT等细胞系中也观察到了这一现象。通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位,我们发现FADD和NKAP可能存在相互作用,并推断FADD可能通过NKAP调控Notch1在小鼠胸腺T细胞中的表达,进而维持其正常生存和发育。