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H5N1亚型高致病性禽流感不仅给养殖业带来了严重的危害,而且威胁人类健康与公共卫生安全。灭活疫苗免疫是目前防控禽流感的有效措施之一,但灭活苗候选株的筛选耗时费力,且疫苗生产过程涉及活病毒,存在生物安全隐患,并受鸡胚供应的限制。禽流感血凝素(Hemagglutinin, HA)亚单位疫苗可以避免灭活苗的缺点,HA蛋白是禽流感病毒主要表面抗原,具有刺激机体产生中和抗体的作用,是研发亚单位疫苗的主要靶标蛋白。其他研究表明杆状病毒表达系统表达的HA+M1蛋白,其生物学活性、抗原性和免疫原性方面与天然HA蛋白极为相似,但是目前关于杆状病毒表达系统表达HA蛋白,其生物学活性、抗原性和免疫原性方面报道相对较少。因此,本研究利用杆状病毒表达系统表达H5亚型禽流感HA蛋白,并对该重组蛋白的血凝活性、VLP (Virus-like particle, VLP)组装、免疫原性等进行研究。构建含HA基因的克隆载体。两种途径获得HA基因。用RT-PCR方法从禽流感(H5亚型,Re-6株)检测抗原中扩增HA基因,命名为L。另根据GenBank中HA基因进行比对分析,选取HA基因序列,命名为H。再根据昆虫细胞的密码子偏嗜性进行优化,合成上述目的基因。以合成的含HA基因的质粒(HHAc-T和LHAc-T)为模板,经PCR扩增、克隆获得包含信号肽和跨膜区(1,857bp)以及不含信号肽和跨膜区(1,701 bp)的HA基因,与pMD19-T克隆质粒连接构建重组克隆质粒H-NSTHA-19T、H-HA-19T、L-NSTHA-19T和L-HA-19T。构建含HA基因的杆状病毒重组表达载体和鉴定重组蛋白。将目的基因从pMD19-T克隆载体,经EcoR I和Hind Ⅲ酶切插入pFastBac1质粒(pF-H-HA、 pF-H-NSTHA、 pF-L-HA和pF-L-NSTHA)。再将上述质粒转染至DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝/白斑筛选获得重组rBacmid (rBac-H-HA、rBac-H-NSTHA、rBac-L-HA、 rBac-L-NSTHA)。用rBacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,收集感染96h后病变细胞的裂解上清。将表达上清液进行系列检测,包括血凝试验、SDS-PAGE、 Western-blot和IFA,验证重组HA蛋白在Sf9细胞中能够大量可溶性表达,并且重组蛋白具有与灭活病毒抗原有相似的血凝活性及免疫原性。用透射电镜观察到重组HA蛋白在体外能够自行组装形成病毒样粒子。鸡体中重组HA蛋白的免疫原性鉴定。通过动物免疫试验验证Sf9细胞表达的重组蛋白的免疫原性。以H-HA、L-HA重组蛋白配制成油乳剂疫苗免疫14日龄的SPF鸡。免疫后第14、21、28天翅下静脉采血,通过血凝抑制试验(H1)和ELISA试验检测抗体效价,结果表明免疫后的各组均能够刺激机体产生较高的抗体。在免疫后的第3、5、7、10天,经FCAS检测CD3+CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群的变化规律和淋巴细胞转化试验。结果表明,2个重组蛋白组鸡的CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群比例稍高于灭活疫苗组,淋巴细胞转化试验亦表明,2个重组蛋白组鸡的淋巴细胞转化效率略高于常规灭活疫苗组。以上结果表明,重组蛋白制备的疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,具有较好的免疫原性,综合效果略优于现有H5亚型禽流感灭活疫苗。综上所述,虽然利用杆状病毒系统表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的血凝价有报道,但是重组HA蛋白的血凝价偏低。本研究利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功地表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白,且重组的HA蛋白有较高血凝价,同时该重组HA蛋白具有较好的免疫原性,为后续研发新型禽用H5亚型禽流感亚单位疫苗提供了理论依据及物质基础。