【摘 要】
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目的:构建稳定过表达APPswe的PC12细胞作为Aβ损伤的离体模型,研究β-细辛醚对于Aβ损伤PC12细胞的保护作用,并从β-细辛醚改善受阻自噬流通畅性的角度,探讨其保护作用的机理,为β-细辛醚改善阿尔茨海默病症状的应用提供更充分的理论依据。方法:1.包装含有APPswe基因的慢病毒,并以此感染PC12细胞。然后通过嘌呤霉素抗性筛选实验,筛选出能稳定过表达目的基因的多克隆稳转株,并以q PCR法
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目的:构建稳定过表达APPswe的PC12细胞作为Aβ损伤的离体模型,研究β-细辛醚对于Aβ损伤PC12细胞的保护作用,并从β-细辛醚改善受阻自噬流通畅性的角度,探讨其保护作用的机理,为β-细辛醚改善阿尔茨海默病症状的应用提供更充分的理论依据。方法:1.包装含有APPswe基因的慢病毒,并以此感染PC12细胞。然后通过嘌呤霉素抗性筛选实验,筛选出能稳定过表达目的基因的多克隆稳转株,并以q PCR法和Western blot法对稳转株进行鉴定。2.以气相色谱-质谱联用法对β-细辛醚纯度进行检测。然后以实时细胞分析系统,筛选出磷酸氯喹（CQ）和β-细辛醚能发挥显著作用的条件。最后以CCK-8法对β-细辛醚减缓Aβ损伤PC12细胞的作用进行验证。3.以PC12细胞作为正常对照组,以过表达APPswe的稳转株细胞作为研究对象设置模型组、β-细辛醚组（72μM）、CQ组（20μM）和CQ+β-细辛醚组（20μM+72μM）。细胞按分组处理24h后,以Western blot法检测Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ、Aβ1-42蛋白的表达量;用mcherry-EGFP-LC3腺病毒对细胞进行感染,然后以共聚焦激光扫描显微镜对细胞自噬流进行观察;以透射电镜对细胞自噬流进行观察。结果:1.成功构建了能够稳定过表达APPswe的PC12细胞。其中嘌呤霉素抗性筛选实验共得到4株多克隆稳转株,以q PCR法和Western blot法对APP的表达情况进行检测,从中筛选出一株能稳定过表达目的基因的细胞株。2.实验所用的β-细辛醚经气相色谱-质谱联用法检测,纯度为99.7%。以实时细胞分析系统筛选出CQ的工作条件为20μM、24h,β-细辛醚的工作条件为72μM、24h。CCK-8法的结果显示:与正常对照组相比,模型组的细胞活性降低（P<0.05）;病毒对照组细胞活性的差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比,β-细辛醚组的细胞活性升高（P<0.05）;CQ组的细胞活性降低（P<0.05）。与CQ组相比,CQ+β-细辛醚组细胞活性的差异无统计学意义（P>0.05）。3.Western blot法的结果显示:与正常对照组相比,模型组Beclin-1、LC3-Ⅱ、Aβ1-42蛋白的表达均升高（P<0.05）,p62蛋白的表达降低（P>0.05）;与模型组相比,β-细辛醚组Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、Aβ1-42蛋白的表达均降低（P<0.05）,CQ组p62的表达升高（P<0.05）,Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白和Aβ1-42蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）;与CQ组相比,CQ+β-细辛醚组Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、Aβ1-42蛋白表达的差异均无统计学意义（P>0.05）。共聚焦激光扫描显微镜下可观察到:各组细胞在绿色及红色荧光通道下,都能发出明显的荧光,部分细胞内可见双色荧光斑点,且荧光斑点的位置基本重合。正常对照组在双色荧光通道下,都未见或少见荧光斑点。与正常对照组相比,模型组双色荧光斑点的数量都明显增加,且绿色与红色荧光斑点的数量基本相当。与模型组相比,β-细辛醚组绿色荧光斑点的数量明显降低,红色荧光斑点的数量略微升高;CQ组双色荧光斑点的数量都进一步增加,且绿色与红色荧光斑点的数量基本相当。与CQ组相比,CQ+β-细辛醚组绿色荧光斑点的数量略微降低,红色荧光斑点的数量略微升高。透射电镜下可观察到:正常对照组中自噬体、溶酶体、自噬溶酶体的数量都较少,溶酶体的体积小,内容物电子密度高且均匀。与正常对照组相比,模型组中自噬体和溶酶体的数量明显升高,自噬溶酶体的数量不变。与模型组相比,β-细辛醚组中自噬体和溶酶体数量略有下降,自噬溶酶体的数量略有上升。与模型组相比,CQ组中自噬体和自噬溶酶体在形态上相互间变得难以区分辨认,内容物庞杂混乱,体积膨大且电子密度极不均匀,数量明显上升;体积小且内容物均一致密的溶酶体的数量明显下降。与CQ组相比,CQ+β-细辛醚组中自噬体和自噬溶酶体的情况略有改善,正常形态的溶酶体数量略有回升。结论:稳定过表达APPswe的PC12细胞表现出明显的Aβ损伤现象,可以作为研究阿尔茨海默病的一种细胞模型。β-细辛醚在PC12细胞受到Aβ损伤时具有一定保护作用,且这种保护作用可能通过改善溶酶体的功能,促进自噬体与溶酶体融合,进而改善细胞内受阻自噬流的通畅性来实现。
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