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研究背景:骨骼畸形是指由先天性或后天性因素导致的骨和软骨解剖结构的异常。研究已证实,一系列的因素均可导致骨骼畸形,比如:遗传因素、环境因素等。其中,遗传因素在骨骼畸形发病过程中发挥着重要作用。近年来,全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）技术的发展使人们从根本上认知了很多疾病发生发展的原因。在前期研究中,我们通过WES技术对早发性脊柱侧弯患者队列进行遗传病因学研究,发现部分早发型脊柱侧凸的患者可以用单基因疾病来解释,如软骨发育不全、Freeman-Sheldon综合征、脊柱骨骺发育不良等。然而,大量研究发现,多种疾病的遗传学致病模式并不遵循经孟德尔遗传模式,这种现象促使人们对更深层次、更复杂的致病原因进行探索。双分子诊断及双基因遗传均为常见的非经典孟德尔遗传形式。双分子诊断指的是同一个体含有两个不同的分子诊断,即存在两个不同的相互独立的致病性的基因突变。一般来说,双分子诊断患者的临床表型常较复杂,通常是由两个独立的致病性突变引起,患者往往同时表现出两种疾病的全部或部分表型。而作为另一种非经典孟德尔遗传形式,双基因遗传模式指两个不同位点的突变共同导致了同一种疾病的发生。此外,先前研究指出,在单基因和寡基因的遗传模式之间存在连续的遗传谱。对于双分子诊断的患者,临床医生很难单纯通过临床表型明确诊断;而由于基因的不完全外显率和表达的差异性,许多疾病可能存在分子诊断的漏诊现象。随着WES技术的飞速发展和广泛应用,越来越多的双分子诊断和双基因遗传模式的患者被发现。然而,目前针对骨骼畸形相关的非经典孟德尔遗传形式的研究仍然很少。研究目的:本研究基于DISCO研究组（系统解析脊柱侧弯多中心协作组,http://www.discostudy.org/）中纳入的来自全国多中心研究中心的多种骨骼畸形队列,筛查双分子诊断患者,全面分析其遗传学特点及临床表型;探索突变基因对与青少年特发性脊柱侧弯（Adolescentidiopathic scoliosis,AIS）的关联;最后,体外实验研究ADAMTSL2-LTBP4突变基因对导致青少年特发性脊柱侧弯发生发展的机制。研究方法:在本课题中,我们纳入了骨骼畸形队列,按照严格的入组排除标准,我们共招募了骨骼畸形队列1384名,主要包括早发性脊柱侧弯（Early-onset scoliosis,EOS）（447 例）、矮小症（561 例）、先天性肢端畸形（Congenital limb malformations,CLM）（74例）、AIS患者（302例）。首先针对矮小症队列分析WES筛查的阳性诊断率,并对所有患者的临床表型进行了分析;随后,从EOS、矮小症、CLM患者队列总共1082名患者中,通过WES识别相关的致病突变,评估WES发现的致病性突变并进行验证,并分析其遗传学特点及临床表型;最后,在AIS患者队列中,采用罕见突变负荷分析研究突变基因对与AIS患者的关联性,免疫共沉淀实验验证ADAMTSL2-LTBP4突变对对ADAMTSL2和LTBP4蛋白结合的影响,蛋白质免疫印迹实验探究ADAMTSL2-LTBP4突变对在AIS患者发病过程中的作用机制。研究结果:对561例矮小症队列通过WES技术进行了致病基因的筛查,总共有135名患者（24.1%）得到分子诊断;在综合征性矮小患者队列中,WES的分子诊断率约为34.9%。此外,我们发现,总共73名患者（13%,73/561）存在除身材矮小之外的骨骼畸形表型;最后,在矮小症队列中还筛查出3名双分子诊断患者。在本研究纳入的EOS、矮小症、CLM患者队列中,通过WES诊断、候选突变评估及验证,我们鉴定了 8名患者（1%）存在双分子诊断。其中,3名（0.7%）来自EOS患者队列,3名（0.5%）来自矮小症患者队列,2名（2.7%）来自CLM的患者个体。此外,我们发现在8名双分子诊断患者中,总共存在12个突变基因包含的16个突变,其中5个是新发（de novo）突变;就突变类型来说,有5个突变是移码突变。此外,在AIS患者队列与对照组队列中,进行突变负荷分析发现ADAMTSL2-LTBP4突变对在AIS患者存在显著富集。进一步体外实验验证得出:ADAMTSL2-LTBP4突变对可导致ADAMTSL2和LTBP4蛋白之间结合力增强,并可以上调磷酸化Smad的表达进而上调TGF-β信号通路。研究结论:WES对于矮小症队列具有较高的诊断率,矮小症患者常合并多种骨骼畸形。基于EOS、矮小症、CLM总共1082名患者的WES队列研究发现8名患者（1%）存在双分子诊断。其中,新发突变和移码突变分别是最常见的突变来源和突变类型。在AIS患者队列中,ADAMTSL2-LTBP4突变对可使ADAMTSL2和LTBP4蛋白之间结合力增强,并通过上调TGF-β信号通路在AIS的发病过程中发挥作用。