第一部分肿瘤细胞与骨髓间充质干细胞相互作用促进内皮细胞表型呈现[目的]利用体外细胞共培养系统研究小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与黑色素瘤细胞的相互作用,观察肿瘤细胞诱导BMSCs向血管内皮细胞分化过程中的表型改变,同时观察BMSCs对肿瘤细胞表达内皮标志分子的诱导作用。为进一步了解在与肿瘤细胞接触的微环境中BMSCs向血管内皮细胞方向分化的程度和特点及其对肿瘤细胞表达内皮标志分子的影响,为肿瘤血管生成中血管内皮细胞的来源研究奠定基础。[方法]1)分离C57BL小鼠股骨骨髓细胞进行原代培养,差速贴壁纯化后进行流式细胞术分析确认BMSCs表型；2)建立Transwell非接触式共培养模型,利用免疫荧光观察共培养过程中BMSCs和黑色素瘤细胞出现内皮细胞的表型变化,利用透射电镜观察诱导后BMSCs细胞内是否出现W-P小体；定时收集共培养细胞和培养基,ELISA检测培养基中VEGF-a水平变化,Western Blot检测细胞裂解液中VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的时序性水平变化；3)利用免疫荧光染色比较非接触式共培养和接触式共培养细胞表型和形态变化。[结果]1)由C57BL小鼠股骨分离获得的细胞,经纯化培养后表型鉴定为CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD166+/CD34-/CD45-/CD133-,符合BMSCs表型；2) mBMSCs与B16细胞共培养72h后,可观察到mBMSCs随着培养时间的推移逐渐呈现并上调血管内皮标志分子CD34、CD45、FactorⅧ、VEGFR-1和VEGFR-2,而原有的CD44和CD105则表达下调；流式细胞术分析显示诱导前FactorⅧ阳性细胞率为1.09%,诱导后为30.17%。超微结构分析发现,经72h诱导后的mBMSCs可在透射电镜下观察到内皮细胞胞浆所特有的Weibe-Palade小体出现。3)非接触式共培养条件BMSCs和B16细胞的增殖率均明显增高,mBMSCs在共培养组倍增时间均值为25.02h、对照组为28.15h,B16细胞在共培养组倍增时间均值为26.30h、对照组为30.76h,差别具有统计学意义；4)非接触共培养体系中,mBMSCs可以被B16细胞诱导出现内皮细胞表型,同样B16细胞也被观察到相关内皮细胞标志分子VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的表达上调。B16细胞和BMSCs直接混合共培养(接触式共培养)72h,发现细胞群体的VEGFR1、VEGFR2和FactorⅧ的阳性细胞率显著降低,可见到B16细胞包绕mBMSCs生长的现象；5)共培养体系中培养液VEGF-a水平随培养时间延长而显著增高。[小结]1)在与肿瘤细胞相互作用的微环境中,BMSCs可以被肿瘤细胞诱导出现表型转变并分化为血管内皮细胞；2)肿瘤细胞亦可与BMSCs相互作用,出现内皮细胞标志分子的上调；3) BMSCs和肿瘤细胞可相互作用,彼此促进增殖；4)培养基中VEGF-a水平的时序性升高与BMSCs和肿瘤细胞出现内皮细胞表型密切相关。第二部分临床病理分析—EMT相关蛋白在人肝癌血管生成拟态中的作用[目的]本部分研究通过对97例随访资料完全的人类肝细胞肝癌临床标本进行分析,观察血管生成拟态(VM)的存在与否及其与临床预后的关系；初步分析上皮-间充质转变(EMT)相关蛋白(表征蛋白E-cadherin、VE-cadherin和调控蛋白Twist1、Twist2、Snail和Slug)和VM相关蛋白(CD31/PAS、MMPs)之间的关系,及其对临床预后的影响,筛选与VM关系密切的EMT相关蛋白,为肿瘤细胞向血管内皮方向塑形研究提供依据。[方法]收集天津医科大学总医院和附属肿瘤医院2001.2-2005.12年经手术切除标本随访资料完整并经病理医师诊断为肝细胞肝癌的病例97例,对临床病历资料和随访资料进行分析；利用HE染色和CD31/PAS双染法观察97例HCC组织中是否存在VM,并计数PAS/VM数量；以免疫组织化学方法检测EMT相关蛋白和VM相关蛋白,分析二者之间的相关性及其与VM、临床预后之间的关系,进行统计学分析。[结果]1)97例HCC临床病例样本,发现18例(18／97,19%)具有典型的VM结构；2) Twist1可弥漫表达于HCC细胞胞浆内,在部分病例表达于细胞核或核浆共表达,局部可出现强阳性灶性表达,Twist1核表达在VM+组和VM-组间差别具有统计学意义,Pearson检验结果显示Twist1-cyto和Twist1-nu均与VM-PAS阳性环计数具有相关性,Twist2、Snail、Slug均与VM关联性不强；3)EMT表征蛋白VE-cadherin与VM具有相关性,与Twist1-cyto、Twistl-nu、Slug均存在相关性,而与Twist2和Snail无相关性；MMP9与VM、Twist1表达存在相关性,MMP2在本研究中与VM、Twist1无关；4)生存分析结果表明Twist1-cyto、Twist1-nu、Snail、VE-cadherin、MMP9表达阳性的病人生存时间较短,E-cadherin阳性病人生存时间较长,Slug和MMP2的表达与否则与生存时间的关系无统计学意义；5)Cox回归分析结果表明Twist1核表达对生存预后影响最大。[小结]1) VM结构主要存在于分化差、恶性度高的实体型及低分化型HCC中,提示VM与HCC恶性生物学行为相关；2)EMT调控蛋白Twist1核表达与VM关联性最为密切,影响病人生存预后；3) Twist1与VE-cadherin、MMP9表达具有相关性,推测肿瘤细胞可能通过Twist1的调节表达VE-cadherin,转变为具有内皮细胞特征的肿瘤相关内皮细胞(TAEs),进而形成VM；4)EMT调控蛋白Twist2、Snail和Slug与VM形成无明确关联性。第三部分Twist1增强肿瘤细胞迁移、侵袭和成血管塑形能力[目的]利用HCC细胞系对Twist1与细胞迁移、侵袭和成血管塑形能力的影响进行体外研究,以进一步证明Twist1和肿瘤细胞塑形、VM的关系,分析Twist1对VE-cadherin表达的调控作用和对MMPs活性的调节。从分子层面研究肿瘤细胞向内皮细胞方向塑形的分子机制。[方法]筛选HCC细胞系,构建Twist1表达质粒和shRNA质粒,转染细胞获得Twist1上调和下调模型,Western Blot和RT-PCR鉴定转染效果；利用细胞伤口愈合实验、Transwell侵袭实验评价Twist1对细胞迁移、侵袭能力的影响,进一步利用Matrigel三维培养模型分析Twist1对细胞管道化塑形能力的影响；利用染色质免疫共沉淀、荧光素酶报告基因检测分析Twist1对VE-cadherin转录的调控作用,利用明胶酶谱法分析Twist1对MMP2和MMP9活性的影响。[结果]1)在HepG2、PLC、SMMC7221、Be17402和Huh-7几种细胞系中,PLC、HepG2、Huh-7等细胞系在mRNA和蛋白水平均呈现为Twistl低表达,Be17402在mRNA和蛋白水平均高表达；2) pcDNA3-Twistl可以明显上调HepG2的Twistl表达,pGP-Twist1-shRNA可有效下调细胞内Twist1表达；伴随Twist1表达改变,细胞表型出现相应变化；3)上调Twist1的HepG2和下调Twist1的Be17402对比分析表明：Twist1可以促进HCC细胞的迁移和侵袭能力；三维培养条件下,上调Twist1可促进HepG2细胞形成管腔样结构,下调Twist1可抑制Be17402细胞形成管腔样结构；4)三维培养条件下,上调Twist1可有助于HepG2细胞表达VE-cadherin,下调Twist1可抑制Be17402表达VE-cadherin;利用染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因分析发现Twist1可能在特定培养微环境下与VE-cadherin启动子区结合并增强其转录活性；5) Twist1的表达上调对HepG2和Be17402细胞MMP2和MMP9的活性均有增强作用。[小结]1) Twist1表达可促进HCC细胞的迁移和侵袭作用；2) Twist1表达可通过上调VE-cadherin促进肿瘤细胞在三维基质中出现管道化塑形；3)在三维培养条件下,Twist1方可与VE-cadherin的启动子区域结合并促进VE-cadherin的转录；4) Twist1表达可促进HCC细胞MMP2与MMP9的活性增强；5) Twist1蛋白是肿瘤细胞经EMT形成VM的重要调节分子。第四部分抗凋亡蛋白Bcl-2与EMT调控蛋白Twist1相互作用[目的]课题组前期工作已观察到缺氧与VM形成密切相关,缺氧可使肿瘤细胞形成“线形程序性坏死”(LPPCN),进而引流血液形成VM,而LPPCN形成又与抗凋亡蛋白Bcl-2家族密切相关。为研究启动Twist1表达和使之行使功能的上游机制,探讨其是否与抗凋亡蛋白有关,本部分研究将模拟缺氧微环境以评价肿瘤细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和Twist1的时相表达。利用酵母双杂交、真核过表达Twist1免疫共沉淀和内源蛋白免疫共沉淀方法分析Twist1与抗凋亡蛋白Bcl-2的直接相互作用,以期进一步明确缺氧微环境诱导肿瘤细胞经EMT机制向血管内皮细胞方向塑形最终形成VM的分子机制,丰富血管生成理论。[方法]利用缺氧袋法制造肿瘤细胞缺氧微环境,以B16细胞系为模型研究缺氧条件下抗凋亡蛋白Bcl-2和Twist1表达的时相性变化；以酵母双杂交系统筛选与Twist1相互作用的抗凋亡蛋白；对肝癌细胞HepG2过表达Twist1后进行免疫共沉淀,分析Twist1与Bcl-2的直接相互作用；在缺氧条件下,进行内源蛋白的免疫共沉淀,分析内源Twist1与Bcl-2的直接相互作用。[结果]1)缺氧处理黑色素瘤细胞B16,经过15h和30h缺氧诱导后B16细胞表达Twist1,可见30h的缺氧显著上调Twist1表达；同时Bcl-2出现时序性表达增强,其中24-36h为表达高峰,随后下降。在30h缓解缺氧可检测到Twistl、VEGFR2、VE-cadherin的高表达；2)酵母双杂交筛选与Twistl相互作用蛋白,结果显示阳性克隆中含有BCL-2基因：3)对HepG2细胞转染pcDNA3-Twistl后48小时,可以检测到Bcl-2上调。利用Co-IP分别以Twist1和Bcl-2抗体钓取,均可在产物中检测到相应的Twistl和Bcl-2；4)在缺氧30h缓解缺氧1d后可以检测到内源Bcl-2和Twistl的相互作用。[小结]1)缺氧可致肿瘤细胞出现Bcl-2、Twistl的响应性表达上调,缺氧-缓解缺氧对Twistl的上调程度高于单纯缺氧；2)酵母双杂交实验表明Twistl蛋白可以与Bcl-2蛋白发生直接相互作用；3)肿瘤细胞过表达Twist1模型可观察到Twist1蛋白与Bcl-2蛋白发生相互作用；缺氧条件下可检测到肿瘤细胞内源Twist1蛋白和Bcl-2蛋白发生相互作用。4)缺氧及抗凋亡机制可能诱导肿瘤细胞发生EMT,抗凋亡蛋白Bcl-2上调可能是EMT的启动因素之一。结论本文通过对BMSCs和肿瘤细胞相互作用向内皮细胞分化、EMT相关蛋白和VM的关系、以及缺氧抗凋亡机制与TAEs形成的关系等多个角度,证明肿瘤细胞向血管内皮细胞方向转变的"LPPCN-EMT-TAEs, LET"理论和TAEs存在的可能及分子机制。其中包括所涉及的Bcl-2与Twist1相互作用、肿瘤相关内皮细胞标志物呈现的时序关系以及相应的组织、细胞在分子和功能学多角度的评价。“LET”理论可以更好的解释肿瘤细胞在特定微环境下的生物学行为,进一步完善肿瘤血管生成理论和EMT理论。同时,其还为肿瘤细胞分化的基础研究提供了新的思路和切入点,对肿瘤血管生成的转化医学研究提供了新的药物靶点和治疗信息,对深入理解肿瘤的生物学行为和临床诊治具有一定得价值和意义。