【摘 要】
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目的:1.评估铁过载对非输血依赖型地中海贫血小鼠骨髓红系造血的损伤效应;2.探讨铁过载是否介导铁死亡（Ferroptosis）途径损伤非输血依赖型地中海贫血鼠模型红系造血方法:1.选取12月龄左右非输血依赖型地中海贫血小鼠为地贫组,同窝别的正常小鼠为对照组,取小鼠全血做全血细胞计数,评估小鼠的贫血状态。2.分离小鼠外周血血清,比色法检测血清铁、ELISA法检测血清铁蛋白,评估小鼠的循环铁负荷状态。
【基金项目】
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项目名称:铁过载介导Ferroptosis途径对非输血依赖性地中海贫血红系造血的损伤效应及机制研究,项目合同编号:81960028,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2020.01-2023.12；
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目的:1.评估铁过载对非输血依赖型地中海贫血小鼠骨髓红系造血的损伤效应;2.探讨铁过载是否介导铁死亡（Ferroptosis）途径损伤非输血依赖型地中海贫血鼠模型红系造血方法:1.选取12月龄左右非输血依赖型地中海贫血小鼠为地贫组,同窝别的正常小鼠为对照组,取小鼠全血做全血细胞计数,评估小鼠的贫血状态。2.分离小鼠外周血血清,比色法检测血清铁、ELISA法检测血清铁蛋白,评估小鼠的循环铁负荷状态。取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、十二指肠和股骨远端行组织病理切片及普鲁士蓝染色,在光镜下观察脏器和骨髓铁沉积状态,以评估小鼠脏器和骨髓的铁负荷状态。3.使用RT-PCR法检测小鼠肝脏细胞铁调素（hepcidin）基因m RNA的表达水平,以评估小鼠铁代谢调节的情况。4.取小鼠全血做网织红细胞计数,分离血清检测血清促红细胞生成素（EPO）水平;将分离的小鼠骨髓单个核细胞标记抗体CD71和TER119,使用流式细胞仪分析细胞群,在FSC vs SSC点图中圈出红系细胞群,再根据抗体的标记情况将红系细胞分为三群:原红细胞（CD71+、TER119-）、早中幼红细胞（CD71+、TER119+）和晚幼红细胞及网织红细胞（CD71-、TER119+）,了解各群红系细胞的比例,以评估骨髓造血活跃程度。5.将分离的骨髓单个核细胞与包含EPO和IL-3等细胞因子的甲基纤维素半固体培养基充分混合后接种于6孔板中培养,培养48小时和9天后于光学显微镜下观察、计数两组小鼠红细胞集落形成单位（CFU-E）和爆式红细胞集落形成单位（BFU-E）的集落数,并使用流式细胞仪检测小鼠骨髓单个核细胞的细胞凋亡率,以评估小鼠骨髓红系造血损伤情况。6.检测反映Ferroptosis水平的指标:使用Cell ROX（?）Deep Red reagent和BODIPY（?）665/676分子探针标记分选后的三群红系细胞,用流式细胞仪检测活性氧（ROS）水平和脂质过氧化水平;使用试剂盒检测小鼠骨髓单个核细胞谷胱甘肽水平;使用RT-PCR法检测小鼠骨髓单个核细胞的GPX4基因的m RNA表达水平;将培养的BFU-E和CFU-E集落细胞从培养基中洗脱,在透射电镜下观察集落细胞的线粒体形态,以评估骨髓细胞Ferroptosis水平。结果:1.与对照组相比,地贫组小鼠外周血的血红蛋白（hemoglobin,Hb）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume,MCV）和平均红细胞血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）均显著下降（P＜0.05）,血清铁和血清铁蛋白均显著高于对照组（P＜0.05）,且地贫组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、十二指肠以及骨髓中铁沉积均较重,而对照组除了脾脏有少量铁沉积外,其余脏器均未见到蓝色铁颗粒。此外,地贫组的铁代谢调节因子hepcidin基因表达水平较对照组下降（P＜0.05）。2.地贫组小鼠的血清EPO和网织红细胞（RET）比例均显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;地贫组骨髓原红细胞和早中幼红细胞的比例显著高于对照组（P＜0.05）,晚幼红细胞及网织红细胞无差异（P＞0.05）。地贫组小鼠的BFU-E集落数少于对照组（P＜0.05）,而两组间的CFU-E集落数无明显差异（P＞0.05）。地贫组小鼠骨髓红系细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均高于对照组,且差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.地贫组小鼠的原红细胞、早中幼红细胞和晚幼红细胞及网织红细胞三群细胞内ROS阳性细胞比例、BODIPY（?）665/676分子探针标记阳性细胞的平均荧光强度均分别显著高于对照组的对应细胞群（P＜0.05）,对照组的原红细胞、早中幼红细胞和晚幼红细胞及网织红细胞三群细胞两两之间的脂质过氧化水平无差异,而地贫组原红细胞的脂质过氧化水平显著高于早中幼红细胞和晚幼红细胞及网织红细胞（P=0.004,P=0.003）,而早中幼红细胞和晚幼红细胞及网织红细胞两群细胞之间脂质过氧化水平无差异（P=0.878）。地贫组小鼠骨髓单个核细胞内谷胱甘肽水平显著低于对照组（P＜0.05）。在透射电镜下观察骨髓BFU-E和CFU-E集落细胞可见地贫组小鼠细胞的线粒体膜出现缺损,线粒体嵴膜连续性出现断裂、嵴膜密度增高,且线粒体嵴数量较对照组减少,而对照组小鼠细胞的线粒体形态正常。结论:1.非输血依赖型地中海贫血小鼠模型的骨髓中存在显著的继发性铁过载状态,且铁过载损伤了骨髓细胞的红系造血功能,并增加了骨髓细胞的凋亡率。2.首次证实铁过载可以通过介导Ferroptosis途径损伤非输血依赖型地中海贫血小鼠模型的红系造血功能。
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