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目的∶脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)是造血细胞特异性表达因子,在免疫受体介导的细胞信号转导通路中发挥着重要作用。近来发现,在多种非造血细胞来源的恶性肿瘤中也存在SYK表达。SYK在实体肿瘤发生发展过程中扮演着双重角色,既能促进癌细胞的生存,又能通过抑制EMT的发生以及加强细胞间相互作用等机制来阻碍肿瘤的恶性发展。由于SYK在肿瘤中功能发挥的多样性,所以SYK的抑制剂还没有用于肿瘤的临床治疗当中。在我国乃至世界范围内,肺癌的发病率和致死率一直居高不下,并且80-85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者。目前针对SYK在肺癌细胞中的研究还很少,而且SYK(L)进入细胞核之后是否参与转录调控作用等并不是很清楚。因此,本研究针对SYK在肺癌中的表达情况、SYK与肺癌患者病理因素的相关性以及SYK在肺癌细胞中发挥的功能和具体参与机制等进行深入研究,希望能够为临床肺癌的诊断和治疗提供实验基础。方法∶1.采用RT-PCR和Western blot方法检测SYK在人肺癌细胞系中的表达情况,通过免疫组织化学方法检测SYK在NSCLC组织中的表达情况。采用细胞粘附实验,划痕愈合实验以及Transwell侵袭实验分析SYK对于NSCLC细胞生物学行为的影响。采用RNA干扰技术下调SYK之后,通过q RT-PCR、Western blot以及免疫荧光方法检测上皮-间质转换(EMT)标志物的变化情况。2.利用免疫荧光和Western blot方法检测SYK在细胞内的定位情况,通过质谱结合免疫共沉淀(Co-IP)方法寻找与SYK(L)相互作用的蛋白。采用RT-PCR和Western blot方法检测Yin Yang 1(YY1)在人肺癌细胞系中的表达情况;通过Co-IP验证YY1与SYK(L)全长及其不同结构域之间的相互作用。采用双荧光共定位系统以及Duolink方法检测YY1与SYK(L)在细胞内的共定位情况。采用Phos-taq SDS-PAGE方法以及Co-IP方法检测SYK对于YY1的磷酸化作用。采用RNA干扰技术分别下调YY1、SYK以及将二者共同下调后,通过Western blot方法检测EMT标志物的表达情况。结合Ch IP、Luciferase以及EMSA实验分析复合物SYK(L)-YY1对于SNAI2基因的转录调控作用。3.采用亚硫酸氢盐直接测序法以及甲基化转移酶抑制剂(5-aza-Cd R)处理的方法共同分析肺癌细胞中SYK基因启动子区域的甲基化修饰情况。结合Ch IP、Luciferase以及EMSA实验分析YY1对于SYK基因的转录调控作用。结果:1.SYK在人肺癌细胞系中存在差异性表达,并且与NSCLC患者生存预后成正相关性(P=0.032)。SYK能够抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移能力,但是促进细胞的粘附能力。在H1155细胞中下调SYK之后,上皮细胞标志物E-cadherin、β-catenin表达显著下降而间质细胞标志物Slug和Vimentin表达升高,Snail和ZEB1变化不明显。此外,下调SYK之后还能促进β-catenin发生明显核转移现象。2.SYK(L)和SYK(S)蛋白在细胞内的定位不同,其中SYK(L)既分布在细胞质又分布在细胞核,而SYK(S)只分布在细胞质当中。经质谱分析发现,SYK(L)与YY1可能存在于同一复合物中,并且二者在细胞核内发生共定位现象。通过Co-IP以及Duolink实验进一步验证发现,SYK(L)与YY1能够相互结合,并且SYK(L)N-端的两个SH2结构域发挥了至关重要的作用。虽然二者之间存在相互作用,但是SYK激酶对YY1并没有磷酸化修饰作用。在SYK阴性A549细胞中下调YY1之后,细胞发生明显的EMT转变,同时发现SYK(L)而非SYK(S)表达升高。但是外源过表达SYK(L)或者SYK(S)之后,细胞形态以及EMT标志物的表达情况没有显著变化。在SYK阳性H1155细胞中下调YY1之后,EMT标志物的变化与SYK阴性细胞中的趋势完全相反。SYK/YY1双下调组与对照组相比,Slug表达明显上升而E-cadherin表达明显下降。Ch IP结果显示,SYK(L)和YY1均能富集到SNAI2基因的启动子区。Luciferase实验结果表明,YY1和SYK对于SNAI2基因的转录调节作用不一,前者发挥促进作用而后者发挥抑制作用。EMSA体外实验结果显示,YY1与SNAI2基因启动子区域存在直接的相互作用。 3.在表达SYK的H209细胞中,其DNA甲基化修饰程度明显低于SYK阴性的Beas-2B细胞和A549细胞。然而经5-aza-Cd R处理之后,Beas-2B细胞中的SYK蛋白水平没有显著变化。Ch IP结果显示,YY1在SYK基因启动子区的顺式调控元件上明显富集。Luciferase实验结果表明,下调YY1之后能够激活SYK基因的转录活性。EMSA体外实验结果显示,YY1与SYK基因启动子区域存在直接的相互作用。结论∶造血细胞特异性表达因子SYK在肺癌细胞系中存在差异性表达,并且SYK的表达水平与NSCLC患者生存时间成正相关性。在NSCLC细胞中下调SYK之后增强了肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,说明SYK对肿瘤转移发挥抑制作用。SYK在细胞中存在两种蛋白异构体形式,其中SYK(L)在细胞质和细胞核内均表达而SYK(S)只在细胞质内表达。SYK(L)入核之后与转录因子YY1产生直接相互作用,但是SYK激酶并不能够磷酸化YY1。内源性SYK(L)和YY1形成复合物共同抑制Slug的表达进而抑制EMT的发生,由此揭示了SYK在肺癌侵袭转移过程中发挥的作用机制。DNA甲基化修饰并不是SYK基因沉默的唯一调控机制,YY1可以通过转录调控作用影响SYK基因的表达水平,为今后SYK基因转录调控方面的研究提供新的思路。