【摘 要】
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目的:本研究以炎性软骨细胞为模型,探讨滑膜间充质干细胞源性外泌体对体外骨关节炎软骨细胞的保护作用,从而为骨性关节炎患者的治疗提供新思路。方法:（1）获得大鼠滑膜间充质干细胞并通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34,CD44,CD45,CD90,以鉴定滑膜间充质干细胞的纯度。（2）收集滑膜间充质干细胞培养的上清液,采用超速离心法提取干细胞源性外泌体,将提取的外泌体置于-80℃冰箱保存,备用。（3）通
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目的:本研究以炎性软骨细胞为模型,探讨滑膜间充质干细胞源性外泌体对体外骨关节炎软骨细胞的保护作用,从而为骨性关节炎患者的治疗提供新思路。方法:（1）获得大鼠滑膜间充质干细胞并通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34,CD44,CD45,CD90,以鉴定滑膜间充质干细胞的纯度。（2）收集滑膜间充质干细胞培养的上清液,采用超速离心法提取干细胞源性外泌体,将提取的外泌体置于-80℃冰箱保存,备用。（3）通过蛋白质免疫印迹、透射电镜和纳米颗粒跟踪技术（Nanoparticle tracking analysis,NTA）等方法对所提取的外泌体进行鉴定。（4）取刚出生24小时龄的大鼠幼崽的膝关节软骨层,用II型胶原酶消化后分离和提取原代软骨细胞,通过光学显微镜镜下观察细胞的形态和甲苯胺蓝染色鉴定是否为软骨细胞。（5）向P2代的软骨细胞中加入10ng/ml的白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）模拟骨关节炎软骨细胞体外模型,之后构建滑膜间充质干细胞源性外泌体与炎性软骨细胞共培养体系。将软骨细胞分为以下五组:（1）未处理的软骨细胞;（2）IL-1β炎性诱导的软骨细胞;（3）IL-1β炎性诱导+40ug/ml外泌体;（4）IL-1β炎性诱导+80ug/ml外泌体;（5）IL-1β炎性诱导+120ug/ml外泌体。通过细胞增殖试验（CCK-8）、划痕试验和凋亡试验（TUNEL检测）等方法检测滑膜间充质干细胞源性外泌体对炎性软骨细胞增殖、迁移和凋亡的影响。结果:（1）本研究使用流式细胞仪对滑膜间充质干细胞表面标记物进行检测,结果显示CD44和CD90阳性抗原高表达（表达率＞99%）,CD34和CD45阴性抗原低表达（表达率＜0.2%）,显示所获得的滑膜间充质干细胞质量较高。（2）通过透射电子显微镜观察所提取的外泌体具有典型的杯口状或双凹面扁平盘状结构;通过NTA测出所提取的细胞外囊泡直径范围在129nm左右;蛋白质免疫印迹技术结果显示,外泌体表面标记物CD9、CD63、CD81高表达,以上说明我们所提取的细胞外囊泡为外泌体。（3）本研究成功从大鼠幼崽的关节软骨中提取出原代软骨细胞,其在光学显微镜下观察呈现为圆形或卵圆形,使用甲苯胺蓝染色后可见细胞胞浆被染成蓝紫色,说明该细胞是软骨细胞。（4）在体外实验中发现,相较于正常软骨细胞,炎症诱导后的软骨细胞的增殖率降低,凋亡比率增高,但迁移率未见明显差异;当加入滑膜间充质干细胞源性外泌体之后,炎性软骨细胞的增殖率和迁移率明显增加,凋亡细胞的比率减少。结论:滑膜间充质干细胞分泌的外泌体可以促进炎性软骨细胞的增殖和迁移,抑制炎性软骨细胞的凋亡,为以后骨性关节炎的治疗提供理论依据和技术手段。
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