论文部分内容阅读
目的:研究let-7i在乳腺癌亲本和耐药细胞中的表达水平差异及其与乳腺癌细胞化疗耐药性的相关性;考察let-7i水平变化对乳腺癌耐药细胞化疗药物敏感性的影响;考察let-7i水平变化对化疗药物诱导的乳腺癌耐药细胞凋亡功能的影响;了解乳腺癌耐药细胞中let-7i水平变化对下游靶基因K-RAS以及相关凋亡蛋白的影响,以探讨let-7i对乳腺癌细胞化疗敏感性的作用及其可能的机制。方法:1.采用RT-PCR的方法验证let-7i在乳腺癌亲本细胞(MCF-7)及对应的耐药细胞系(MCF-7/ADR、MCF-7/DDP)中的表达及其与乳腺癌细胞化疗耐药的相关性;2.用脂质体转染的方式在耐药细胞系中过表达或抑制let-7i的表达,以CCK-8的方法检测耐药细胞对阿霉素(Adriamycin,ADR)的IC50,验证let-7i水平变化对乳腺癌耐药细胞化疗耐药性的影响;3.采用平板克隆形成实验评价let-7i水平变化对乳腺癌耐药细胞化疗药物敏感性的影响;4.采用流式细胞术和Caspase3/9活性检测评价let-7i水平变化对耐药细胞的凋亡诱导作用的影响;5.采用RT-PCR和Western–blot的方法检测let-7i水平变化对下游靶基因K-RAS以及相关凋亡蛋白的影响。结果:1.let-7i水平变化对乳腺癌耐药细胞化疗药物敏感性的影响。(1)相比于乳腺癌亲本细胞(MCF-7细胞),let-7i在乳腺癌耐药细胞(MCF-7/ADR,MCF-7/DDP)中的表达水平明显下调。(2)在MCF-7/ADR,MCF-7/DDP细胞中过表达let-7i后,MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞对阿霉素的化疗敏感性均有所增高;而在MCF-7/ADR,MCF-7/DDP中抑制let-7i表达后,MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞对阿霉素的化疗敏感性均降低。(3)平板克隆形成实验检测发现,相同化疗药物浓度下,let-7i过表达能够抑制MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞的细胞集落形成能力,而抑制let-7i的表达能够促进MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞的细胞集落形成能力。2.let-7i水平变化对乳腺癌耐药细胞凋亡功能的影响。(1)流式细胞术检测结果表明,在相同药物浓度下,对于由阿霉素诱导的细胞凋亡检测实验,let-7i过表达能够提高MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞的凋亡程度。(2)Caspase 3/9活力实验表明,在相同药物浓度下,let-7i过表达能够提高MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞的Caspase 3/9活力。(3)Western-blot检测结果表明,随着阿霉素浓度梯度的增加,促凋亡蛋白Bax水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。3.let-7i水平变化在MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞中对下游靶基因K-RAS以及相关凋亡蛋白的影响。(1)相比于乳腺癌亲本细胞,K-RAS基因表达在相应MCF-7/ADR和MCF-7/DDP中明显升高;同时,相比于MCF-7细胞,MCF-7/ADR和MCF-7/DDP细胞中Bcl-2表达升高。(2)RT-PCR和Western-blot检测结果表明,在MCF-7/ADR和MCF-7/DDP中过表达let-7i的表达水平后,Bcl-2、K-RAS不仅在mRNA水平表达降低,在蛋白水平的表达也降低。结论:在乳腺癌耐药细胞中,miRNA let-7i表达与乳腺癌细胞的化疗耐药性成负相关。过表达let-7i水平,能够增加乳腺癌耐药细胞的化疗敏感性,促进乳腺癌耐药细胞的凋亡功能,可能通过调控K-RAS和Bcl-2/Bax通路而影响乳腺癌耐药细胞的化疗敏感性。