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背景及目的:凝血酶是凝血级联反应的核心蛋白酶,除了发挥其凝血功能以外,研究表明它还可能与哮喘的发病机制有关。我们前期的研究发现,应用于临床抗凝的直接凝血酶抑制药物达比加群,能有效减轻鸡卵清白蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠模型的气道重塑病理改变,但其对凝血酶诱导的人气道平滑肌细胞(HASMCs)的功能变化是否存在作用尚不清楚。Yes-associated protein(YAP)是Hippo信号通路的关键分子,通过影响细胞增殖和分化等来调节器官大小和组织稳态。最近的研究发现YAP在哮喘小鼠模型的气道平滑肌中高表达,但YAP是否参与凝血酶诱导的HASMCs功能变化未见报道。因此,本研究的目的是探讨达比加群对凝血酶诱导的细胞增殖、迁移和重塑相关蛋白上调的影响,明确YAP在凝血酶诱导的HASMCs功能变化中的作用,以及凝血酶调控YAP的潜在分子机制。方法:我们使用原代HASMCs作为研究模型。使用CCK-8、EdU实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;qRT-PCR、Western Blot分别检测细胞外基质蛋白Collagen Ⅰ、纤维化蛋白α-SMA、YAP下游靶蛋白CTGF和Cyclin D1的mRNA和蛋白表达;Western Blot检测通路蛋白的表达;免疫荧光检测YAP核质定位和细胞骨架F-actin的变化;免疫荧光双染共定位、CoIP检测YAP与SMAD2的结合。结果:1.达比加群对凝血酶诱导的HASMCs重塑的作用(1)达比加群呈浓度和时间依赖性抑制凝血酶诱导的细胞增殖,在3000ng/ml的浓度及48h的作用时间抑制作用最大;(2)达比加群抑制凝血酶诱导的细胞迁移;(3)达比加群抑制凝血酶诱导的Collagen Ⅰ、α-SMA、CTGF和Cyclin D1的mRNA和蛋白上调。2.达比加群对凝血酶诱导的YAP激活的影响(1)凝血酶呈时间依赖性促进YAP去磷酸化及核转位,在1h激活作用最大;(2)达比加群抑制凝血酶诱导的YAP去磷酸化及核转位。3.YAP对凝血酶诱导的HASMCs重塑的作用(1)敲低YAP或使用YAP抑制剂verteporfin均抑制凝血酶诱导的细胞增殖;(2)敲低YAP或使用YAP抑制剂verteporfin均抑制凝血酶诱导的细胞迁移;(3)敲低YAP或使用YAP抑制剂verteporfin均抑制凝血酶诱导的Collagen Ⅰ、α-SMA、CTGF 和 Cyclin D1 的 mRNA 和蛋白上调。4.凝血酶激活YAP的机制研究(1)PAR1抑制剂SCH79797抑制凝血酶引起的下游RhoA、ROCK、p-MLC2上调,F-actin聚合和YAP去磷酸化及核转位;(2)RhoA抑制剂Y-16抑制凝血酶引起的下游ROCK、p-MLC2上调,F-actin聚合和YAP去磷酸化及核转位;(3)ROCK抑制剂Y-27632抑制凝血酶引起的下游p-MLC2上调,F-actin聚合和YAP去磷酸化及核转位;(4)F-actin解聚剂Cytochalasin D抑制凝血酶引起的F-actin聚合和YAP去磷酸化及核转位;(5)凝血酶促进YAP与SMAD2结合及核转位。结论:1.达比加群通过抑制凝血酶诱导的YAP激活从而减轻HASMCs重塑;2.凝血酶通过PAR1/RhoA/ROCK/MLC2信号轴引起细胞骨架F-actin聚合而导致YAP激活,并促进其与转录因子SMAD2的结合,从而介导下游靶基因的表达。