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油莎豆（Cyperus esculentus.L）是一种特色经济油料作物,其地下块茎组织储藏油脂含量高达干重的25～30%,且富含优质的油酸（60%-75%）。作为现今唯一已知块茎富油的植物,油莎豆被认为是研究非种子器官或营养器官中油脂代谢及其调控机制的一个理想模型。应用分子生物学和组学工具,深入挖掘油莎豆控制块茎油脂合成的关键酶基因,可为在植物营养器官组装油脂富集代谢途径,特别是增加高生物量营养器官中油脂和优质脂肪酸积累的植物油脂代谢工程提供更优异的基因资源。植物果实和种子的储藏油脂绝大多数为三酰甘油（Triacylglycerols,TAG）。高等植物细胞在质体中从头合成脂肪酸,并随后转运到细胞质在内质网上合成TAG。二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferases,DGAT）控制TAG合成最后一步酰化反应,即催化酰基-Co A和二酰基甘油（diacylglycerol,DAG）生成TAG。DGAT被认为是TAG生物合成的关键性限速酶之一,已鉴定的DGAT酶蛋白至少可分为三个家族,即DGAT1,DGAT2和DGAT3。在油莎豆块茎发育过程中,各DGAT如何协同控制油脂合成和积累?哪个DGAT对油酸有底物特异性而促使油酸富集?以及各DGAT是否可差异化行使功能?这些科学问题还有待回答。为此,本文应用组学工具全基因组鉴定油莎豆DGAT基因并分离其c DNA克隆,分析DGAT基因的时空表达谱和所编码蛋白的理化特性。分别构建各DGAT基因的酵母表达载体和植物表达载体。通过在酵母（Saccharomyces cerevisiae）TAG-缺陷型突变体H1246异源表达及转基因酵母表型鉴定,以及培育获得纯合的转基因烟草株系和表型分析,系统论证这些油莎豆DGAT基因的生物学功能。研究有助于深入解析油莎豆块茎油脂生物合成分子机制,可为阐明植物营养器官脂肪酸和油脂生物合成的调控机理提供新见解。主要研究结果如下:1.对油莎豆块茎发育和储藏物质积累的动态分析表明,在太谷地区所种植的油莎豆（晋农1号）块茎成熟时期为145 DAS（块茎播种后天数）左右。油脂积累的动态特征为:初期（50-90 DAS）油脂含量低增长缓慢,中期（90-120 DAS）油脂迅速大量积累,后期（120-145 DAS）油脂含量增速减缓至稳定。油莎豆块茎的干重、可溶性糖和淀粉积累亦呈现了相似的动态趋势。然而,蛋白质含量在块茎发育初期至中期缓慢增加,120 DAS开始减少至成熟时稳定。2.系统分析本实验室油莎豆块茎转录组测序数据,获得3个具有完整阅读框（ORF）的油莎豆DGATs,即1个DGAT1（CeDGAT1）和2个DGAT2（CeDGAT2-1和CeDGAT2-2）基因。CeDGAT1 ORF长度为1509 bp,编码502个氨基酸;CeDGAT2-1和CeDGAT2-2 ORF长度分别为1017 bp和954 bp,分别编码338和317个氨基酸。应用NCBI的CDD库检测CeDGATs蛋白保守结构域,结果显示,CeDGAT1与At DGAT1同属MBOAT超家族,CeDGAT2s与At DGAT2同属LPAAT超家族。系统发育分析表明,CeDGAT1蛋白被归入DGAT1家族,而CeDGAT2s被归入DGAT2家族,3个CeDGATs蛋白与拟南芥同源性较低,而与禾本科植物的各自直系同源序列相似性最高。3.应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测油莎豆CeDGATs在不同组织、不同发育时期块茎的表达谱。结果表明,3个基因在根,叶和块茎中均有表达,其中CeDGAT1在根中高表达,CeDGAT2-1在叶中高表达,CeDGAT2-2在块茎中高表达,暗示着3个基因分别在不同组织中行使功能。在块茎的不同发育时期,3个基因均呈现出先增加后降低的趋势,且在中期90DAS的表达量最高。但是,各基因的表达水平存在明显差异,CeDGAT2-2是3个CeDGATs基因中表达量最高者。在90DAS时,CeDGAT2-2表达量分别是CeDGAT1和CeDGAT2-1的3倍和11倍。应用高保真RT-PCR技术成功从油莎豆块茎中克隆到表达量高的CeDGAT1和CeDGAT2-2的编码序列。4.分别构建CeDGAT1、CeDGAT2-2酵母表达载体（pYES2-CeDGAT1和pYES2-CeDGAT2-2）,并在TAG合成缺陷酵母H1246菌株中异源表达,获得阳性转基因酵母菌株。尼罗红染色和薄层色谱层析（TLC）发现,CeDGAT1和CeDGAT2-2都能使H1246酵母菌株恢复TAG生物合成,提高受体细胞油脂积累。转基因酵母细胞的含油量分别是空载酵母细胞的1.37倍和1.48倍。转基因酵母都积累了较多的单不饱和脂肪酸（棕榈油酸C16:1和油酸C18:1）。尤其是CeDGAT2-2转基因酵母,C18:1含量高达49.98%,显著高于对照,表明CeDGAT2-2对油酸有较高的底物特异性。5.分别构建CeDGAT1、CeDGAT2-2植物组成型表达载体（pBI121-CeDGAT1和pBI121-CeDGAT2-2）,通过农杆菌浸染叶盘法对普通烟草（Nicotiana tabacum）进行遗传转化,获得纯合转基因烟草植株。对转基因烟草营养器官叶片组织油脂、淀粉、蛋白和可溶性糖进行测定。结果显示,与空载对照相比,过表达CeDGAT1、CeDGAT2-2烟草植株的总油脂含量分别增加了6.25倍和7.15倍。转CeDGAT1、CeDGAT2-2烟草叶片中不饱和脂肪酸的水平（C18:1,C18:2）增加,而饱和脂肪酸（C16:0和C18:0）的含量相应减少。特别是油酸（C18:1）显著升高,从空载的5.1%分别增加到为21.9%、31.33%,表明两种DGAT酶可能有相似的底物特异性,尤其是CeDGAT2-2对18:1选择性更高。转CeDGAT1、CeDGAT2-2烟草叶片中淀粉含量显著下降,可溶性糖含量增加,蛋白含量并未发现明显的变化。此外,与对照相比,转基因植株叶绿素含量和烟草种子的发芽率未发现显著变化,这说明CeDGAT1、CeDGAT2-2异源过表达没有对烟草植株的生长和其它农艺性状造成不良影响。总之,来自油莎豆块茎的两种CeDGATs都具有二酰基转移酶活性,能显著促进营养器官中油脂的生物合成,提高油酸的含量,且并未产生显著的负面效应。这两个优异基因可用于基因工程在高生物量营养器官富集油脂,促进优质食用或工业用油的可持续绿色高效生产。