研究背景:肉毒毒素（BoNTs）上市距今已有30余年,从最初用于治疗肌肉痉挛到现在,临床应用领域已大大增加,肉毒毒素不仅被用于对抗各种以肌肉过度收缩为特征的疾病,包括肌张力障碍、痉挛、神经源性逼尿肌过度活动等;肉毒毒素还被广泛应用于注射美容领域。随着市场的爆炸增长,目前监管不能及时跟上,出现了一些因非正规渠道注射肉毒毒素而中毒的事件,非正规来源的“肉毒毒素”其制作工艺、保存条件等不达标,肉毒毒素含量可能远远超过标注,以及注射人员往往非医学专业,这些因素造成了极大隐患。由于注射性肉毒毒素中毒患者症状特征多样,实验室检查也缺乏特异性指标,目前诊断主要依靠症状和注射史。在治疗上,主要以马源性血清免疫球蛋白（肉毒抗毒素/抗毒素）为主,辅助以对症支持治疗,必要时需气管插管。但是,抗毒素的疗效依赖于使用的及时性,其说明书中标注应在48小时内使用,使得实际工作中延迟治疗的患者经常无特异性药物可用。关于抗毒素的使用时间窗以及其他新药物的开发成为学者们热衷探究的问题。本文的主要目的是:一、通过临床常用的各种检测检验手段去寻找注射性A型肉毒毒素中毒的特异性诊断指标;二、观察肉毒抗毒素对注射性肉毒毒素中毒患者的治疗疗效;三、针对注射性肉毒毒素中毒开发一种可量化的动物模型,并用来探索抗毒素以外新型药物的疗效。第一部分注射性肉毒毒素中毒患者和健康求美志愿者的临床资料分析方法:我院从2018年8月至2021年12月共收治12例A型肉毒毒素（BoNT/A）中毒患者,将她们的临床资料进行收集整理,筛选有价值的临床检查指标,并以肉毒抗毒素（A型）为主要治疗,观察最终每名患者的治疗效果。此外,我们于2020年11月招募了10名自愿接受美容肉毒毒素注射并完成相关检测的健康志愿者,她们接受正常剂量的BoNT/A注射,并在注射前进行电生理、眼科检查、心脏超声、血液检验等检查,注射后10天复查对比。结果:1.肉毒毒素中毒患者的检查:我们对肉毒毒素中毒患者进行外周血的血液细胞学检查,在部分患者中性粒细胞胞质内发现中毒颗粒。在电生理检查中,有几种不同类型的异常出现,包括:运动神经传导速度MCV延长（2例）,三叉神经诱发电位潜伏时TSEP延长（1例）,视觉诱发电位潜伏时VEP延长（1例）,2种不同类型的重复电刺激RNS衰减。在眼科检查中,仅在复视图（2例）和眼睑板腺检查（3例）有异常。2.肉毒毒素中毒患者的治疗:12例患者经过抗毒素治疗恢复情况良好。3.健康志愿者的检查:10名志愿者前后检查的血常规、尿常规、大便常规、肝肾功能、电解质、凝血功能、炎症标志物、降钙素原、免疫球蛋白、补体、心肌酶谱、心衰标志物、胆碱酯酶、血细胞学检查、心脏超声、电生理检查、眼科检查均无异常。结论:1.对于肉毒毒素中毒的疑似患者,血液实验室检查、电生理检查、眼科检查是早期诊断与鉴别的重要手段;2.对确诊肉毒毒素中毒患者应早期申请使用肉毒抗毒素治疗;3.通过正规医疗途径的肉毒毒素注射是安全的。第二部分肉毒毒素中毒大鼠模型建立方法:1.使用10U、20U两个剂量的BoNT/A对大鼠进行腹腔注射（并设置对照组）,注射后对大鼠的耗氧量、外观进行连续监测;2.使用6U、30U两个剂量的BoNT/A对大鼠进行腓肠肌注射（并设置对照组）,注射后对大鼠的耗氧量、体重及外观进行连续监测;3.注射前1天、注射后7天分别对6U组、30U组大鼠进行尾部采血,做血液细胞学检查。结果:1.正常8周龄大鼠的耗氧量为20.75±3.61ml/（kg·min）,10U、20U组大鼠未出现明显耗氧量下降;2.正常大鼠的体重随时间而增长,6U组、30U组大鼠的体重增长缓慢,存活的30U组大鼠在7天左右体重下降达最高峰,由第一天的201.8±2.9g下降到188.1±35.0g;3.6U组、30U组大鼠血液涂片检查无明显规律,6U组大鼠都没有出现中毒颗粒,30U组1只大鼠在注射前发现中毒颗粒,1只在注射后出现中毒颗粒;4.存活的30U组大鼠耗氧量从2～3天开始下降,第4～5天达到最低点,后开始恢复,耗氧量14天左右即可恢复到之前状态;5.30U组大鼠中出现了明显的肉毒毒素中毒症状,包括蜂腰、反常呼吸、注射肢体脚趾麻痹、眼睑下垂甚至眼眶流血等。结论:1.通过30U BoNT/A后肢腓肠肌注射,我们成功诱导了大鼠耗氧量的下降,同时通过体重、外貌等的潜在中毒指标的观察,也得到了与耗氧量下降同步的结果,再次印证了耗氧量是反映肉毒毒素中毒的可靠指标;2.6U、10U、20U组大鼠没有明显出现耗氧量的下降,在注射性肉毒毒素中毒中,中毒剂量较小,耗氧量模型可能不能完全满足需求;3.关于中毒颗粒是否是肉毒毒素中毒的特征表现,目前仍无法定论。第三部分3,4-二氨基吡啶在注射性肉毒毒素中毒治疗中的应用方法:1.使用贝叶斯最优区间（BOIN）法估算大鼠腓肠肌注射的半数致死剂量;2.对大鼠后肢进行一定量的BoNT/A注射,筛选出能稳定的诱导出其余肢体的部分麻痹症状的剂量,通过检测前肢抓力的变化及时间来反应大鼠的中毒情况;3.在中毒大鼠不同病程阶段（中毒后6小时、中毒后7天分别代表立即治疗和延迟的治疗）给予3,4-DAP治疗,观测肌力变化及持续时间。结果:1.大鼠的半数致死剂量LD50估计值为125U/kg;2.在低剂量(0.2LD50)下大鼠不会出现注射肢体以外的肢体麻痹症状,在亚致死剂量(0.8LD50)下大鼠前肢抓力在注射后6.00±1.86小时后开始下降,由原来的2.28±0.19N下降至1.51±0.18N;3.在致死剂量下(2LD50)大鼠前肢抓力下降出现更早（4.29±0.42小时）,由原来的2.30±0.20N下降至1.20±0.16N;4.在大鼠中毒后6小时、中毒后7天（分别代表立即治疗和延迟的治疗）进行3,4-DAP治疗（单剂量或连续剂量治疗）,都可以短暂逆转肌肉麻痹症状。结论:1.大鼠前肢抓力模型可以良好的模拟注射性肉毒毒素中毒;2.3,4-DAP可在注射性肉毒毒素中毒的不同阶段有效缓解症状。