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全球气候变暖与化石能源枯竭是人类社会面临的两大挑战,寻找一种清洁、可再生的新型能源迫在眉睫。生物乙醇因其低污染、可再生的特点,成为替代不可再生化石燃料的新型优势能源。酿酒酵母与运动单胞菌作为生产乙醇的重要工业菌株,存在着底物谱窄等缺点,而嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense）可以直接利用木质纤维素水解的单糖,具有底物谱广、发酵周期短等特点,被认为是生产燃料乙醇理想的生物催化剂,但存在菌体生长与醇乙能生产力差、生产成本高等问题。本课题从氨基酸对嗜热厌氧杆菌产醇能力的影响出发,通过代谢改造手段强化外源甲硫氨酸摄取与内源甲硫氨酸合成,并从胞内还原力水平、磷酸戊糖途径关键酶酶活以及胞内氧化应激损伤三个方面初步探究甲硫氨酸影响菌株生长的机理,最后通过优化培养基进一步降低生产成本,实现菌株高效生产乙醇。本研究首先在DSMZ固体培养基中分别添加不同氨基酸（组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸）,比较它们对嗜热厌氧杆菌生长的影响,结果显示甲硫氨酸能显著促进菌株生长。进而在MTC培养基中,分别以不同碳源为底物添加不同浓度的甲硫氨酸进行摇瓶发酵,发现以木糖为底物,当甲硫氨酸浓度达到20 mg/L时,乙醇产量与葡萄糖消耗速率分别达到最高4.57 g/L和0.58 g/（L·h）,与不添加甲硫氨酸相比分别提高69.26%和56.76%。为进一步提高乙醇产量与糖代谢能力,采用同源重组的方式敲除甲硫氨酸阻遏蛋白基因metJ,强化胞内甲硫氨酸的合成与胞外甲硫氨酸的摄取,得到工程菌株T.aotearoense SCUT27Δldh/ΔmetJ。在MTC培养基中以不同碳源为底物发酵时,T.aotearoense SCUT27Δldh/ΔmetJ乙醇产量、生长、糖代谢能力均优于出发菌株T.aotearoense SCUT27Δldh,其中以木糖为底物时,乙醇产量比对照提高30.74%,木糖代谢速率提高24.32%;继续优化甲硫氨酸的添加量,在以木糖为底物、添加甲硫氨酸浓度为30 mg/L时,工程菌发酵性能最佳,菌株生长与乙醇产量、得率均显著提高,OD600=4.73,乙醇产量为7.45 g/L,得率达到0.38 g/g。为探究甲硫氨酸促进菌株生长及产醇的机理,本研究首先证实工程菌对甲硫氨酸的摄取能力增强,比对照（25.00 mg/L VS 16.36 mg/L）提高约56.25%,并检测与甲硫氨酸转运和摄取相关的基因及与NADPH相关基因（metN,metQ,metI,G6PDH,6PGDH）的转录水平,胞内还原力水平,氧化应激水平以及磷酸戊糖途径关键酶酶活。结果显示以上基因相对表达量显著上调,T.aotearoense SCUT27Δldh/ΔmetJ胞内总还原力水平增加,NADPH含量增加,导致乙醇产量提高;高浓度的NADP+会激活葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,强化磷酸戊糖途径,提高木糖的利用能力,胞内氧化应激降低有利于增强细胞活力。为进一步降低发酵成本优化培养基组成,在嗜热厌氧杆菌MTC培养基中分别添加1 g/L酵母提取物,4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨以及不同浓度的玉米浆,结果显示添加4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨,T.aotearoense SCUT27Δldh/ΔmetJ以不同碳源为底物发酵性能均最佳,与添加30 mg/L L-methionine发酵性能相当。为进一步降低发酵成本,采用DL-methionine代替L-methionine,添加30 mg/L DL-methionine乙醇产量为7.47 g/L,最后进行分批补料游离发酵,乙醇最高产量达到27.85 g/L,木糖最大消耗速率达到1.38 g/（L·h）。综上所述,甲硫氨酸添加能促进嗜热厌氧杆菌的生长与产醇;敲除甲硫氨酸阻遏蛋白能显著强化菌株对外源甲硫氨酸的摄取与内源甲硫氨酸的合成,进一步改善菌株的发酵性能;甲硫氨酸主要是通过强化磷酸戊糖途径影响菌株的发酵性能。