论文部分内容阅读
目的:化学药物治疗作为鼻咽癌基础治疗方式之一,已经在临床中发挥了巨大的作用。由于个体对药物敏感性的不同,容易导致耐药,因此亟需合适的解决办法。如今,有相关研究证实,eratin作为一种诱导细胞发生铁死亡的小分子,能很好的增强传统抗癌药物如阿霉素、顺铂、阿糖胞苷、替莫唑胺等对某些癌细胞的治疗效果,但尚未有研究证明erastin能否增强鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性。本实验拟研究erastin对鼻咽癌耐药株的化疗增敏作用,探究铁死亡激活剂erastin联合顺铂（DDP）是否能诱导鼻咽癌顺铂耐药细胞株发生死亡及其相关机制,为鼻咽癌治疗药物选择提供新思路。方法:用含有顺铂的1640培养基培养顺铂耐药HNE-1鼻咽癌细胞株,使其保持对顺铂的耐药性,通过CCK-8法检测鼻咽癌普通细胞株HNE-1、CEN2Z、HONE-1和顺铂耐药株对顺铂的敏感性,观察各细胞株的活性,用于确定顺铂耐药株细胞HNE-1/DDP用于后续实验。通过CCK-8法检测鼻咽癌普通细胞株HNE-1、CEN2Z、HONE-1和顺铂耐药株对erastin的敏感性,确定耐药株是否对erastin敏感,观察其自身是否能对耐药株有抗肿瘤作用。将erastin与DDP联合处理HNE-1/DDP,再通过CCK-8法测定erastin、DDP联合处理后HNE-1/DDP细胞活性变化,观察其联合作用的抗肿瘤效果,确定药物浓度。为了探索erastin发挥的具体作用,通过PI染色利用流式细胞仪观察不同处理如对照组、DDP组、Erastin组、DDP+Erastin组、Erastin+ferrostatin-1组、Erastin+DDP+ferrostatin-1组的细胞死亡现象。为了进一步验证erastin联合DDP是否诱导耐药株发生了铁死亡,通过流式细胞仪检测不同分组细胞的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的变化,Fe~2+和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒检测细胞Fe~2+水平和MDA水平的变化。最后,探索erastin联合DDP对HNE-1/DDP的抗肿瘤效应,通过q RT-PCR实验以及Western blot实验分别在检测铁死亡相关基因m RNA和蛋白表达情况,并且通过划痕实验验证Erastin联合DDP对HNE-1/DDP的迁移影响。结果:DDP和erastin以剂量依赖性明显降低普通鼻咽癌细胞系的活力,而HNE-1/DDP耐药株对DDP的敏感度远低于普通鼻咽癌细胞系,其IC50高达49.42±7.04μg/ml,验证了耐药株的形成,并且耐药株对erastin的敏感度也远低于其他普通细胞。而在联合erastin与DDP后,HNE-1/DDP细胞erastin的IC50值由45.89±6.89μmol/L降低至17.56±4.07μmol/L（P=0.004）,提示联合处理能增强抗肿瘤能力。PI染色流式细胞学结果证实,相较于erastin或DDP单独处理HNE-1/DDP时的死亡率均不超过30%,erastin联合顺铂处理HNE-1/DDP细胞死亡率提高至89.69%±9.48%,且铁死亡抑制剂ferrostatin-1能逆转erastin联合DDP所诱导的细胞死亡,使其死亡率降至35.81%±8.2%,提示了联合处理的肿瘤杀伤能力相较于单独处理大大增强,并且这种抗肿瘤效果能被铁死亡抑制剂所逆转。后续结果显示,当单独处理时,ROS水平增高均不超过15%,而联合处理后,ROS水平提高至18.72%±3.05%。联合处理还提高了细胞内Fe~2+与MDA水平,并且这些变化都能被铁死亡抑制剂ferrostatin-1所逆转,使细胞内ROS水平、Fe~2+与MDA水平降低,证实了铁死亡的发生。q RT-PCR实验结果显示联合处理后铁死亡相关基因x CT与GPX4的表达有所下降,抗氧化基因NRF2与下游HO-1表达升高,而Western blot实验结果显示x CT的蛋白表达水平却未明显下降,提示联合处理虽然使x CT转录有所下降,但没有降低其蛋白水平的表达。GPX4的蛋白表达结果与m RNA结果一致,NRF2细胞内整体蛋白水平也升高不明显,HO-1的蛋白表达变化与m RNA一致,且ferrostatin-1也能逆转GPX4表达的降低与HO-1表达的升高。划痕实验结果提示联合处理还降低了耐药株的迁移能力。结论:本实验结果表明,相较于单独使用顺铂时,Erastin联合顺铂后能明显诱导顺铂耐药株HNE-1/DDP死亡,并且降低了其迁移能力,且初步验证了其死亡方式为铁死亡,NRF2-GPX4/HO-1参与了该铁死亡的过程。erastin有望改进鼻咽癌的治疗。