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蜡梅切花因其花期独特、花色素雅、香气怡人而深受消费者喜爱。近年来,重庆、四川、河南、上海等地的蜡梅切花产业得到迅速发展。作为切花,瓶插寿命的长短直接影响其观赏品质和市场竞争力。如何延缓蜡梅花衰老引起了研究人员的广泛关注,目前已有一些蜡梅切花采后生理及保鲜的研究,但关于蜡梅花衰老的分子调控机制的研究鲜有报道。为了解蜡梅花衰老的调控机制,本实验室前期构建了蜡梅花转录组数据库,通过对差异基因表达谱的分析,发现有WRKY家族成员基因在蜡梅花衰老时期显著上调表达,推测其可能与蜡梅花衰老有一定的关系。为进一步探讨WRKY基因在蜡梅花衰老过程中的功能,本研究在克隆分离得到蜡梅WRKY基因的基础上,对它们的基本特性、表达特性及生物学功能进行分析。主要研究结果如下:（1）根据蜡梅花转录组数据库中已知的基因序列信息,克隆获得蜡梅WRKY家族基因中两个基因的c DNA序列,分别命名为Cp WRKY46和Cp WRKY71。Cp WRKY46的c DNA全长1491 bp,包括一个355 bp的5’-UTR区,一个107 bp的3’-UTR区,和一个1029 bp的开放阅读框。Cp WRKY71的c DNA全长1137 bp,包括一个93 bp的5’-UTR区,一个93 bp的3’-UTR区,和一个951 bp的开放阅读框。同时,以DNA为模板克隆获得Cp WRKY46和Cp WRKY71的g DNA序列,Cp WRKY46的g DNA全长2143 bp,包含两个长度分别为87 bp和565 bp的内含子;Cp WRKY71的g DNA全长2231bp,包含两个长度分别为417 bp和677 bp的内含子。（2）蜡梅Cp WRKY46和Cp WRKY71基因编码蛋白的结构特征。Prot Param在线预测Cp WRKY46蛋白的分子式为C1646H2559N463O541S12,蛋白质分子量为37.87k D,理论等电点为5.44。氨基酸组成中丝氨酸（Ser）所占的比例最大,为14.0%（48/342）,其次是脯氨酸（Pro）,为7.9%（27/342）,总平均亲水性-0.698,是一个亲水性蛋白。Cp WRKY46包含一个WRKY保守结构域和C2HC型的锌指结构,属于第Ш亚家族成员。Cp WRKY71蛋白的分子式为C1510H2304N434O491S17,蛋白质分子量为34.93 k D,理论等电点为6.6,氨基酸组成中丝氨酸（Ser）所占的比例最大,为15.2%（48/316）,其次是脯氨酸（Pro）,为9.2%（29/316）,总平均亲水性-0.884,是一个亲水性蛋白。Cp WRKY71包含一个WRKY保守结构域和C2H2型的锌指结构,属于第Ⅱc亚家族成员。（3）为了解Cp WRKY46和Cp WRKY71是否具有转录因子的基本特性,我们对Cp WRKY46和Cp WRKY71的亚细胞定位情况和转录活性进行分析。在烟草表皮细胞瞬时表达分析表明Cp WRKY46和Cp WRKY71均定位在细胞核。在酵母系统分析转录活性,结果显示Cp WRKY46和Cp WRKY71均能转录激活酵母细胞中的HIS3和Lac Z报告基因的表达,表明Cp WRKY46和Cp WRKY71都具有转录激活活性。（4）基因的表达模式能在一定程度上反映基因的功能。为了解Cp WRKY46和Cp WRKY71基因可能的生物学功能,利用q RT-PCR检测了Cp WRKY46和Cp WRKY71基因在蜡梅中的表达模式。在不同组织中,Cp WRKY46在根、茎、幼叶、花中的表达量低于在衰老叶片中表达量;而Cp WRKY71在花中表达量最高,衰老的叶片中表达量次之。在花发育的不同时期,Cp WRKY46基因在花朵初衰期的表达量最高,萼片原基和雌蕊原基发育时期中的表达量次之;Cp WRKY71基因在花朵初衰期表达量最高,花朵盛开期的表达量次之。（5）为解析Cp WRKY46的表达调控特点,我们用染色体步移法分离获得1671bp的Cp WRKY46的启动子序列Pro Cp WRKY46。序列分析表明Pro Cp WRKY46含有乙烯、水杨酸、赤霉素、脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件。利用ACC、水杨酸、赤霉素、脱落酸、Me JA处理蜡梅及转Pro Cp WRKY46:GUS的拟南芥幼苗后发现,Cp WRKY46和GUS基因的表达均受到这几种激素处理的影响,表明Cp WRKY46可能参与激素介导的生物学过程。同时,Pro Cp WRKY46:GUS转基因植株的GUS染色结果显示,Pro Cp WRKY46驱动的GUS基因在根、茎、叶龄小的叶片、花蕾、初开的花朵中的表达能力远低于叶龄大的叶片、盛开的花朵及花衰老时期的花器官离层部位,说明Cp WRKY46的功能可能与衰老有关。（6）为探索Cp WRKY46基因的功能,利用花序浸染法将Cp WRKY46转入拟南芥,分析转基因植株的表型变化。与对照相比,转基因植株衰老显著提前,伴随着叶绿素含量下降和衰老相关基因SAG12和SAG13的表达上调。利用基因表达谱测序技术对转基因植株中发生明显变化的基因进行分析,发现有6个衰老相关基因、13个乙烯途径相关基因及6个水杨酸途径相关基因的表达受到上调。为进一步解析Cp WRKY46调控衰老的机制,对过表达植株中的乙烯、水杨酸、脱落酸和茉莉酸途径的相关基因进行表达分析,结果显示乙烯和水杨酸途径基因表达量显著上调,而脱落酸和茉莉酸途径相关基因的表达水平并未发生明显变化,表明Cp WRKY46可能通过促进乙烯和水杨酸的生物合成,进而导致转基因植株衰老提前。（7）为进一步解析Cp WRKY71的表达调控特点,克隆得到4170 bp的Cp WRKY71的启动子序列Pro Cp WRKY71。序列分析发现Pro Cp WRKY71含有低温、高温、干旱、水杨酸、脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件。4℃、42℃、PEG600、水杨酸、脱落酸和茉莉酸处理蜡梅及转Pro Cp WRKY71:GUS的拟南芥幼苗后发现,Cp WRKY71和GUS基因的表达均受到这几种处理的影响,表明Cp WRKY71可能参与非生物胁迫和激素响应。同时,Pro Cp WRKY71:GUS植株的GUS染色结果显示,Pro Cp WRKY71驱动的GUS基因在根、茎和幼叶的表达水平远低于衰老叶片,蕾期和初开期花朵的GUS活性低于盛开期和衰老期,表明Cp WRKY71基因的功能可能与衰老有关。（8）为研究Cp WRKY71基因的功能,将Cp WRKY71异源过表达拟南芥。与对照相比,过表达Cp WRKY71基因的转基因拟南芥莲座叶数目减少和花期显著提前。对转基因植株中开花关键基因的表达量进行分析发现,FT、LFY、AP1、FUL及CAL的表达量显著上调。此外,Cp WRKY71转基因拟南芥还表现出早衰表型,同时叶绿素含量降低和衰老相关基因SAG12和SAG13的表达升高。为充分验证Cp WRKY71基因的功能,用叶盘法将其转入矮牵牛。过表达Cp WRKY71的矮牵牛表现出叶片和花朵提前衰老的表型。综上所述,Cp WRKY46和Cp WRKY71是两个在衰老的叶片和花中优势表达的WRKY转录因子基因。亚细胞定位和转录活性实验证明这两个WRKY蛋白都定位在细胞核且具有转录激活活性。异源表达Cp WRKY46和Cp WRKY71基因均引起了转基因植株衰老提前的表型,且伴随着衰老相关基因SAG12和SAG13基因表达量上调。进一步对转Cp WRKY46基因的拟南芥进行分析,发现转基因拟南芥中水杨酸和乙烯途径相关基因的表达水平也受到不同程度的上调。Cp WRKY46及Cp WRKY71的表达模式和异源表达的结果均表明这两个基因可能参与了蜡梅花衰老的调控。