胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤是神经系统中最常见的两种固体肿瘤。由于将近80%的胶质母细胞瘤患者年龄超过60岁,而神经母细胞瘤患者多数在18个月以下。即使在手术治疗及放化疗后,胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤患者的预后情况依旧不理想。因此寻找可靠的肿瘤标志物对于胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤的治疗具有十分重大的意义。WD结构重复蛋白家族包含着数十个成员,它们参与包括细胞周期,凋亡以及自噬在内的多种细胞活动的调控。研究表明,该家族基因可以作为多种疾病的治疗靶点,如儿童肥胖综合症,骨细胞与骨流失以及肿瘤。其家族成员WDR5,作为MLL组成的H3K4甲基转移酶复合体中的一员,与白血病的发生密切相关。同时,WDR5还可以通过与多种转录因子（Myc,MLK1及OCT4）组成复合体,调控下游基因的表达。C-Myc与N-Myc均属于Myc原癌基因家族,因此两者具备许多的相似点。作为转录因子,两者都可以通过识别并结合到靶基因启动子上的E-Box序列（CACGCG或CACGTG）,从而激活下游基因的表达。目前为止部分Myc下游基因已被证明参与到许多细胞生理过程,如葡萄糖代谢,凋亡以及DNA损伤等,但依旧有许多Myc下游基因及功能有待研究。本文中,我们发现WDR5促进胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞的增殖。数据库及免疫印迹实验表明,CARM1是WDR5-Myc的下游靶基因。同时我们还发现WDR5通过与Myc结合并诱导H3K4me3,促进Myc结合到CARM1启动子上。双荧光素酶报告系统结果表明Myc结合于CARM1转录起始位点上游-520—-515区段。以上结果揭示了一种通过WDR5-Myc复合体调控胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤的增殖及肿瘤发生的新模式。辅助共激活相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）即精氨酸甲基转移酶4（PRMT4）,最初被认为是类固醇激素受体的辅助激活剂。其能够参与到前体m RNA的剪切,细胞增殖和分化调控。CARM1在乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌中的高表达,会导致患者预后变差,说明其在肿瘤中扮演着癌基因的角色。为阐明CARM1在胃癌中的作用,利用sh RNA敲低CARM1后,胃癌细胞的增殖及体外克隆形成能力显著减弱。CARM1作为转录辅助因子能够通过诱导Notch2启动子上H3R17me2,从而激活Notch2信号通路。同时利用质谱技术鉴定了CARM1的结合蛋白,并通过IF等实验发现Nup54能够通过与CARM1结合,促进其核转运。不仅如此,我们还发现Notch2是CARM1的底物,CARM1所催化的Notch2三位点精氨酸（R1786,R1838及R2047）甲基化促进Notch2胞内域（N2ICD）与MAML1的结合。CARM1催化的Notch2甲基化能够促进胃癌细胞增殖及肿瘤生长。本文数据证明了CARM1在调控Notch2信号通路及肿瘤发生的重要性,主要研究结果如下:1、WDR5是胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤的潜在癌基因首先利用R2基因组分析与可视化平台,分析WDR5在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤中的表达。四个不同子数据库数据均表明WDR5在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤中的表达显著上调。同时Tumor Glioma-Kawaguchi-50和Neuroblastoma-public-Versteeg-88数据表明,高表达WDR5会导致患者预后变差。在四个胶质母细胞瘤细胞系和四个神经母细胞瘤细胞系中检测WDR5表达,结果表明WDR5在胶质母细胞瘤（A172,LN229,U251 MG和U87 MG）和神经母细胞瘤（SK-N-AS,BE（2）-C,SK-N-DZ和SHEP1）细胞中均有表达。为探究WDR5在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤中的作用,使用sh RNA沉默WDR5的表达。MTT实验表明,下调WDR5后,LN229和BE（2）-C细胞的增殖速率均显著减缓。同时,Soft-Agar实验表明,相对对照组而言WDR5敲低组所形成的克隆数目更少,克隆体积也更小。这些结果表明,在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤中WDR5可能是一个癌基因。2、WDR5-Myc复合体上调CARM1的表达虽然WDR5作为Myc的转录辅助因子已被证实,但WDR5-Myc复合体具体调控这哪些基因的表达依旧不清楚。通过R2平台分析基因表达相关性,我们发现CARM1表达与WDR5-Myc复合体表达呈正相关关系。并且在敲低Myc或WDR5后,CARM1的m RNA及蛋白表达均显著降低。基于以上实验结果,我们推测WDR5及Myc能参与CARM1的转录调控。为验证这一假设,我们进行Ch IP分析,结果表明WDR5和Myc均能结合到CARM1启动子区域。通过双荧光素酶报告系统,我们对WDR5-Myc复合体在CARM1启动子的具体结合位点进行研究,发现其结合在CARM1转录起始位点上游-520—-515的E-Box序列上。为研究WDR5是否为Myc调控CARM1所必须的,我们在WDR5和Myc表达量相对较低的A172和SHEP1细胞中过表达Myc。过表达Myc后,CARM1的m RNA和蛋白表达均上调,但在WDR5敲低后,CARM1表达则不受过表达Myc的影响。同时Ch IP实验也表明,沉默WDR5后,Myc及H3K4me3在CARM1启动子上的富集明显减少。上述实验数据表明WDR5通过诱导CARM1启动子区域的H3K4me3,促进Myc对CARM1的转录激活。3、CARM1在胃癌中高表达且能促进细胞增殖利用Oncomine分析CARM1在胃癌中的表达情况,结果表明CARM1在胃癌中的表达显著升高,q RT-PCR及WB实验结果也表明CARM1在胃癌细胞中的m RNA及蛋白表达都显著高于正常胃粘膜细胞。同时Kaplan-Meier数据库分析表明高表达CARM1会导致胃癌患者预后情况变差。利用sh RNA敲低CARM1后,进行MTT、Brd U及Soft-Agar实验,结果表明沉默CARM1后胃癌细胞的增殖和体外克隆形成能力均受到抑制。总结而言,CARM1在胃癌中可能是一个癌基因。4、Nup54通过与CARM1结合,促进CARM1的核转运利用Co-IP和MS技术鉴定CARM1的结合蛋白,结果发现CARM1与Nup54相互结合。为了研究Nup54对CARM1蛋白的影响,我们利用sh RNA下调Nup54的表达,发现CARM1的表达无明显变化,说明Nup54不影响CARM1蛋白的稳定性。由于Nups蛋白主要负责核质间的大分子运输,且CARM1定位于细胞核,我们推测Nup54调控着CARM1的核定位。细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提实验结果表明沉默Nup54会导致CARM1滞留于细胞质。并且IF实验结果表明,在Nup54沉默的细胞中,CARM1荧光信号会出现在细胞质中。以上实验结果说明Nup54促进CARM1的核转运。5、CARM1通过诱导Notch2启动子上H3R17me2激活Notch2信号通路为对CARM1在胃癌中的作用进行更深入的研究,我们分析了数条与增殖相关的信号通路,发现Notch2信号通路基因在CARM1缺失的细胞中变化最为明显。由于沉默CAMR1后,Notch2的m RNA及蛋白表达均显著降低,我们推测CARM1可能参与Notch2的转录调控,因而展开Ch IP实验,结果表明CARM1的确能够结合到Notch2启动子上。作为转录辅助因子,CARM1可通过上调靶基因启动子区域的H3R17me2和H3R26me2水平,从而促进转录因子对启动子的结合。在敲低CARM1的细胞中,检测到H3R17me2和H3R26me2表达的下调。基于前期研究基础,我们利用H3R17me2和H3R26me2抗体进行Ch IP实验,结果表明敲低CARM1会降低H3R17me2在Notch2启动子上的富集,而对H3R26me2基本没有影响。以上实验结果表明,CARM1通过促进H3R17me2在Notch2启动子上的富集,上调Notch2的表达。6、Notch2鉴定为CARM1底物Co-IP及MS实验表明CARM1蛋白与Notch2蛋白存在结合,由于EVH1结构域是CARM1识别和结合底物的结构域,并且通过构建截短载体及IP实验,我们发现Notch2仅与CARM1的EVH结构域结合,其可能是CARM1的底物。跨膜蛋白Notch2经过金属蛋白酶和γ-分泌酶剪切,释放出Notch2胞外域（N2ECD）和Notch2胞内域（N2ICD）,而CARM1定位于细胞核中,因此我们构建了融合Myc标签的N2ICD载体,用于检测沉默CARM1后,N2ICD的ADMA水平的变化情况。结果发现N2ICD的ADMA水平会由于CARM1的沉默而显著降低,说明Notch2是CARM1的底物。N2ICD包含四个结构域（RAM、AR、TAD及PEST）,为找到N2ICD与CARM1结合的结构域,我们构建了单独表达四个结构域的载体。将所构建的载体与融合Flag标签的CARM1共转染到HEK293FT细胞中,通过IP实验发现N2ICD通过PEST结构域与CARM1结合。进而分别构建N2ICD其他三个结构域与PEST融合的载体,研究N2ICD受甲基化的结构域,发现N2ICD的AR结构域受CARM1催化。在线数据库及相关文献表明AR结构域共存在四个可能受甲基化的精氨酸位点（R1786,R1787,R1838和R2047）。将四个精氨酸位点分别突变,结果发现仅R1787位突变对N2ICD的ADMA水平没有影响,说明CARM1能够催化R1786,R1838和R2047位点的甲基化。为了研究CARM1是否还存在其他作用位点,我们构建了三个位点突变（R1786K,R1838K和R2047K）的载体,发现三位点突变载体(N2ICDTM)的ADMA水平不受CARM1表达高低的影响。这说明CARM1仅催化N2ICD AR结构域内R1786,R1838和R2047的甲基化。7、N2ICD甲基化促进其与MAML1的结合及胃癌的发展在进入细胞核后,N2ICD通过其AR结构域与MAML1结合,并与RBPjk组成转录复合体,调控下游基因表达。因此基于前期实验结果,我们推测N2ICD的甲基化可能影响其与MAML1的结合。为验证这一推测,我们利用N2ICD野生型(N2ICDWT)与突变型(N2ICDTM)进行IP实验,结果显示N2ICDTM与MAML1的结合能力显著弱于N2ICDWT。同时MTT及Soft-Agar实验结果表明,沉默Notch2对胃癌细胞增殖及体外克隆形成能力的抑制作用,能被过表达N2ICDWT所挽救,而过表达N2ICDTM基本没有影响。同时小鼠移植瘤实验也得到与体外实验一致的结果。以上实验结果表明,N2ICD的甲基化能够通过促进其与MAML1的结合并促进胃癌的发展。