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目的：高危型人乳头瘤病毒（human papillomaviarus, HPV）是90%宫颈癌的病因，其中HPV16和18型约占70%。高危型HPV持续性感染宿主细胞，并将其致癌基因E6/E7整合到宿主细胞中使其永生化并具备了侵袭和转移能力是宫颈癌的主要发病机制。上皮细胞转化为间质细胞的过程称为上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。发生EMT的上皮细胞失去细胞间的粘附，获得了间质细胞的形态和特性，典型的特征就是上皮的E-cadherin转换为间质的N-cadherin。EMT的发生机制与肿瘤的侵袭、转移密切相关，因此它也是多种肿瘤研究的焦点，但是在宫颈癌中的研究仍然较少，宫颈上皮细胞EMT的发生是否与高危型HPV相关迫切需要我们更深入地研究。多种信号途径与EMT的发生相关联，Wnt通路就其中一条很重要的信号途径。Wnt通路异常激活诱导肿瘤EMT的发生在多种肿瘤的研究中得到证实，但在宫颈癌的EMT中发挥何种作用尚不清楚。综上所述，我们推断高危型HPV可能经Wnt信号通路诱导宫颈癌EMT的发生。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来新兴起的一门在转录后水平上沉默目的基因的技术。siRNA、shRNA和miRNA都是RNAi的有利工具，尽管体内体外的各种转染技术多种多样，但是RNAi技术显示出了明显的高效、特异性，也因此成为了一种有利的研究手段。本课题组的前期试验证明，沉默HPV16E6/E7基因可以在体外抑制宫颈癌细胞的EMT过程，但缺乏体内试验研究。本实验采用RNA干扰技术分别抑制人宫颈鳞癌SiHa细胞裸鼠移植瘤中HPV16E6/E7基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用，并观察对EMT指标E-cadherin、N-cadherin以及Wnt和β-catenin的作用，由此证实HPV16E6/E7对宫颈鳞癌EMT和Wnt通路的作用。方法：1培养HPV16阳性的人宫颈癌细胞SiHa。2扩增并提取miRNA干扰质粒，包括HPV16E6-miRNA、 HPV16E7-miRNA干扰质粒和1个阴性对照Neg-miRNA空白质粒。3将SiHa细胞接种到BALB/c裸鼠右前腋窝中部外侧皮下,观察成瘤情况并分随机分成4组,包括2个对照组和2个治疗组。对照组为生理盐水组（简称盐水对照组）和空质粒组（Neg-miRNA组），治疗组为HPV16E6基因沉默组（HPV16E6-miRNA组）和HPV16E7基因沉默组（HPV16E7-miRNA组）。4用体内转染试剂溶解miRNA质粒，定期定量对4组裸鼠分别行瘤内多点注射生理盐水、 Neg-miRNA、 HPV16E6-miRNA、 HPV16E7-miRNA。每次注射前测量肿瘤体积，观察沉默E6/E7基因对肿瘤生长的影响。5移植瘤取材，测移植瘤长短径和瘤重，分装标本，分别用Real-TimePCR和免疫组化技术检测目的基因的mRNA及其蛋白的表达情况，包括HPV16E6、HPV16E7、E-cadherin、N-cadherin、Wnt1和β-catenin。分析E6/E7基因沉默对移植瘤生长、EMT指标和Wnt通路的影响。结果：1裸鼠皮下移植瘤的建立1.1荷瘤小鼠全部存活，大约皮下接种20天后，肉眼可见明显的移植瘤，体积约为约80-120mm3,成瘤率100%。肉眼观察裸鼠移植瘤外形不规则，个别瘤体可出现溃破和出血。实验中4组小鼠均无明显精神萎靡,行动迟缓及消瘦等变化，接种SiHa细胞前和处死前的小鼠体重无明显变化。1.2剥除后大体观察瘤块：肿瘤为非浸润性生长，有胞膜，与周围组织界限清楚，易分离，质硬，瘤体切面可见灰白色坏死灶，未见明显血管。2通过体内分别沉默HPV16E6和E7基因，两个miRNA处理组裸鼠移植瘤在小鼠被处死前的体积均小于两个对照组，P<0.05，同样肿瘤重量也明显减轻，P<0.05。3各组中HPV16E6和E7mRNA的表达采用Real-Time PCR的方法，分别检测HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA转染的各组以及空质粒组和盐水对照组的HPV16E6和E7mRNA的表达。HPV16E6基因沉默组与盐水对照组比较，HPV16E6mRNA的表达水平降低，差异显著，P<0.05，具有统计学意义；空质粒组和HPV16E7基因沉默组分别与盐水对照组比较，HPV16E6mRNA的表达无差异，P>0.05，无统计学意义。HPV16E7基因沉默组与盐水对照组比较，HPV16E7mRNA的表达水平降低，差异显著，P<0.05，具有统计学意义；空质粒组和HPV16E6基因沉默组分别与盐水对照组比较，HPV16E7mRNA的表达无差异，P>0.05，无统计学意义。这组数据说明HPV16E6-miRNA和HPV16E7-miRNA瘤内注射成功促使SiHa细胞宫颈癌裸鼠移植瘤中的HPV16E6/E7基因沉默。4EMT的标志物E-cadherin和N-cadherin mRNA和蛋白的表达水平采用Real-Time PCR和免疫组化方法，分别检测4组移植瘤中E-cadherin和N-cadherin mRNA和蛋白的表达水平。HPV16E6基因沉默组和HPV16E7基因沉默组分别与盐水对照组比较，E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平均升高，N-cadherin mRNA和蛋白的表达均降低，P<0.05，差异具有统计学意义。空质粒组与盐水对照组比较，E-cadherin和N-cadherinmRNA和蛋白的表达水平无差异，P>0.05，无统计学意义。本实验说明SiHa细胞宫颈癌移植瘤中的HPV16E6/E7基因沉默后发生了“钙粘蛋白的转换”，N-cadherin转换为E-cadherin。5Wnt信号通路中Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表达水平采用Real-Time PCR和免疫组化方法，分别检测4组移植瘤中的Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表达水平。HPV16E6基因沉默组和HPV16E7基因沉默组分别与盐水对照组比较，Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表达水平均降低，P<0.05，差异具有统计学意义。空质粒组与盐水对照组比较，Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表达水平无差异，P>0.05，无统计学意义。说明SiHa细胞宫颈癌移植瘤中的HPV16E6/E7基因沉默后，Wnt/β-catenin信号转导途径受抑制。结论：1成功建立了SiHa细胞宫颈鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型，可用于宫颈癌的体内研究。2体内研究进一步证实我们前期利用体外实验筛选出的HPV16E6-miRNA和HPV16E7-miRNA可以特异、高效的沉默HPV16E6和E7基因。3沉默HPV16E6/E7基因可以抑制SiHa细胞宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。4沉默HPV16E6/E7基因可促使宫颈癌EMT发生逆转，且这个过程可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路完成。