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目的:针对一类多糖含量高的新型铁皮石斛,采用目标起始密码子（SCoT）分子标记技术对11种石斛进行遗传多样性和聚类分析,建立这类高糖铁皮石斛的分子鉴别质量标准。以该石斛为君药,配伍五味子、黄芪、葛根等中药,进行工艺研究,制备铁皮石斛辅助降血糖胶囊,建立颗粒制剂等质量标准。并按照SFDA保健品要求,进行辅助降血糖药效学研究。方法:1.铁皮石斛‘睿绅2号’的遗传多样性和聚类分析及其基因鉴别采用目标起始密码子（SCoT）分子标记技术来分析11种石斛品种。对其PCR反应体系和扩增程序进行优化;对36条SCoT通用引物进行筛选,及其退火温度的优化;进行遗传多样性和聚类分析;采用SCoT-SCAR标记和SCoT-Nested PCR标记两种组合作为鉴定铁皮石斛‘睿绅2号’的工具。2.铁皮石斛复方胶囊制备工艺研究采用正交试验设计方法,以葛根素、五味子醇甲、黄芪甲苷含量和浸膏得率作为综合评价指标优化提取工艺;采用湿法制粒,以颗粒的休止角、成型率和堆密度等,单因素优化处方制剂工艺,制备铁皮石斛复方胶囊。3.降血糖功能的药效学研究采用SD大鼠高脂饲料喂饲3周后,给予大鼠腹腔注射链脲佐菌素（28 mg/kg）以复制胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱型模型。实验分为正常对照（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、阳性药物组（二甲双胍）与铁皮石斛复方胶囊高、中、低剂量（1.0、0.5、0.25 g/kg）组,灌胃给药,连续28 d,每周称体质量;在灌胃给药四周后测定空腹血糖值;实验末期进行糖耐量实验,测定血清总胆固醇（TC）、胰岛素水平（INS）。结果:1.SCoT-PCR分析建立石斛SCoT-PCR最佳反应体系（20μL）:DNA模板20 ng,Mg2+2.0 mM,dNTPs 0.2 mM,Ex Taq DNA聚合酶1.0 U和引物0.5μM。扩增程序:94℃预变性3min;94℃变性1 min;52℃退火1 min;72℃延伸2 min;35个循环;最后72℃延伸10 min。SCoT标记在11份石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和可重复性。2.遗传多样性和聚类分析利用SCoT分子标记对11种石斛进行遗传多样性和聚类分析,从36个条SCoT引物中筛选出的13条引物,共扩增出181条带,其中157条为多态性条带,多态性比86.86%,聚类结果表明不同栽培品种的铁皮石斛聚在一起,而将其它品种区分,表明SCoT标记具有多态性丰富、特异性扩增能力强的特点,适合石斛种质鉴别研究。3.SCoT-SCAR标记和SCoT-Nested PCR标记两种组合鉴别SCoT-Nested PCR组合分子标记表明,利用引物SC1,SC2和SC3对铁皮石斛‘睿绅2号’进行特异性鉴别。然而SCoT-SCAR组合分子标记设计的3对引物,不能在11种石斛栽培品中将铁皮石斛‘睿绅2号’区分,但是可以在11种石斛栽培品中,将其他9种石斛和鼓槌石斛、尖刀唇石斛区分。两种标记对比的使用更加证实了实验结果的稳定性和真实性,建立了分子鉴别质量标准,为铁皮石斛‘睿绅2号’鉴定提供理论指导。4.“龙头凤尾”铁皮石斛‘睿绅2号’分子鉴别质量标准（1）基因组DNA的提取与检测采用植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取“龙头凤尾”铁皮石斛‘睿绅2号’幼苗总DNA,所得DNA用超微量紫外可见分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量(A260/A280=1.8-2.0;A260/A230≥2.0)及完整性,并将DNA浓度稀释至20 ng/μL,-20℃保存备用。（2）SCoT-PCR标记的扩增（一次扩增）对样本使用SCoT引物S8（5’-CAACAATGGCTACCACGT-3’）进行SCoT扩增。SCoT-PCR反应体系为20μL:DNA模板20 ng,Mg2+2.0 mM,dNTPs 0.2 mM,Ex Taq DNA聚合酶1.0 U和引物0.5μM,不足用dd H2O补足;扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min;52℃退火1 min;72℃延伸2 min;35个循环;最后72℃延伸10 min。并将第一次SCoT-PCR的扩增产物（浓度约400-500 ng/μL）,稀释1000倍（浓度约0.4-0.5 ng/μL）,作为第二次扩增的DNA模板来进行二次PCR扩增。（3）SCoT-Nested PCR标记的扩增（二次扩增）对一次扩增稀释1000倍的产物,任选1对特异性引物:引物SC1（523bp）:上游引物（5’-TGGCTACCACGTGATAGATGT-3’）下游引物（5’-GTTTCTTAGGAGGAATTGCTCAG-3’）引物SC2（1017bp）:上游引物（5’-TCCAGCGGAAAGGGAGATAC-3’）下游引物（5’-ACTTTCCCTCCCAAGCTGAG-3’）引物SC3（1178bp）:上游引物（5’-CTCGCCATATCGTCGAGCA-3’）下游引物（5’-ACGTTCTGTTATGGGGTCCT-3’）进行二次扩增。二次PCR反应体系为20μL:10μL Ex Taq PCR Master Mix,分别2μL 2.5 mM引物,1μL模板,不足用dd H2O补足。PCR仪扩增条件如下:94℃预变性4分钟,94℃变性50 s,58℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环,最后72℃延伸8分钟。扩增反应结束后,取8μL扩增产物,向样品中加入2μL 6×loading buffer,在1%琼脂糖凝胶（含核酸染料）中电泳分离,最后在凝胶成像系统观察和记录。（4）结果判定若二次扩增结果中,能在相应大小位置扩增出条带,则可将其幼苗继续进行下一步栽培;反之,则将变异的幼苗剔除。5.铁皮石斛复方胶囊的制备工艺:称取处方量五味子、葛根、黄芪三位药材,用10倍量的30%乙醇,提取3次,每次1 h,合并滤液,过滤,滤液经减压浓缩,真空干燥后,加入铁皮石斛超微粉混匀,湿法制粒,70%乙醇润湿,将制得颗粒50℃～60℃,干燥2小时左右,将干燥后的颗粒过20目筛,整粒,直接填充胶囊。颗粒成型率为96.15%,休止角α=35.21°,堆密度p=0.2758;对于颗粒装量差异、颗粒水分含量等,各项均符合要求。6.铁皮石斛复方的降血糖药效学实验:给药四周后,与正常对照组比较,模型组大鼠血糖水平、血糖曲线下面积、总胆固醇含量显著增加（P<0.01）,血清胰岛素含量显著减少（P<0.01）;与模型组比较,铁皮石斛复方胶囊高、中剂量组大鼠血糖水平、血糖曲线下面积、总胆固醇含量显著减少（P<0.05）,血清胰岛素含量,模型大鼠体质重显著增加（P<0.05）。结果表明:铁皮石斛复方胶囊高、中剂量对链脲佐菌素加高脂饲料致胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱型模型大鼠具有一定降糖作用,能使模型大鼠胰岛素分泌增加,并能降低血清胆固醇含量。结论:利用SCoT分子标记对11种石斛进行遗传多样性和聚类分析,并成功将“龙头凤尾”铁皮石斛‘睿绅2号’鉴别,建立分子鉴别质量标准;通过正交试验设计和单因素方法确定铁皮石斛复方胶囊制备工艺;药效学试验表明所研制的铁皮石斛复方胶囊具有降血糖作用,可开发为辅助降血糖功能食品。本研究能够提高该品种石斛的质量标准,其制剂产品具有较好的降血糖作用。