溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）的一种,是严重的胃肠道疾病之一,近年在我国的发病率有逐年上升的趋势,但目前治疗效果仍欠佳。黄芩汤为清热止痢、和中止痛的古方,临床上多用于胃肠道疾病的治疗,但与其他许多中药一样,成分复杂,有效物质基础不明,作用机制不清,有待进一步研究。UC属于慢性非特异性结肠炎,与免疫性炎症相关,属免疫性疾病。研究发现固有免疫的受体和传感器“核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family,pyrin domain-containing 3,NLRP3）炎症小体”是炎症反应的核心,在UC的炎症过程中扮演着重要角色。故本课题以NLRP3炎症小体为切入点,采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的UC小鼠模型和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的RAW264.7细胞炎症模型,探究黄芩汤及其药效成分对UC小鼠的治疗作用,并深入研究了其药效成分治疗效果的机制。目的:本研究旨在通过黄芩汤对DSS诱导的UC小鼠症状和病理改变的作用,评价黄芩汤对UC小鼠的治疗作用,并利用液相质谱联用分析技术,筛选出黄芩汤中在结肠中含量较高的成分。在研究药效的基础上,进一步探讨其对NLRP3炎症小体的作用,以期通过活性成分对UC小鼠及炎性细胞模型中NLRP3炎症小体的形成和活化的影响,证明黄芩汤药效成分可以通过干预NLRP3炎症小体达到治疗UC的目的。方法:1.黄芩汤对DSS诱导的UC小鼠的治疗作用采用分层随机的方法将C57BL/6小鼠分成6组,即正常组、模型组、柳氮磺吡啶组和黄芩汤高、中、低剂量组。除正常组外,其余各组自由饮用3%DSS 7天以建立UC模型,实验第1-10天,分别采用灌胃给药的方式给予纯净水、柳氮磺吡啶和不同剂量的黄芩汤,每天记录体重变化、粪便的状态。实验第11天,分别取小鼠外周血、脾脏及结肠等,计算脾脏指数,采用动物血细胞分析仪检测外周血中各种血细胞比例以及通过HE染色观察结肠组织病理改变。采用免疫组化的方法检测结肠组织中巨噬细胞的分布。2.黄芩汤各主要活性成分的组织分布基于前期黄芩汤药效研究基础上,采用高分辨率四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）研究黄芩汤中主要活性成分（黄芩苷、汉黄芩苷、甘草苷、甘草酸和芍药苷）在组织（心脏、肝脏、肾脏和结肠）的分布情况。正常小鼠灌胃给予1g/m L的黄芩汤,分别于给药后0.5h,1h,3h和12h取样检测。建立混合标准品在各个脏器分布的标准曲线,采用电喷雾正离子（electrospray ionization,ESI）模式检测黄芩苷、汉黄芩苷、甘草苷和甘草酸,采用负离子模式检测芍药苷在组织中的含量,根据标准曲线,计算各活性成分在不同组织中不同时间点含量的变化。3.汉黄芩苷通过影响NLRP3炎症小体治疗UC的机制探究3.1汉黄芩苷对UC小鼠的治疗作用对汉黄芩苷干预后的UC小鼠,分析其体重、结肠长度、脏器指数、结肠组织形态和外周血白细胞的数目的变化,评价汉黄芩苷对UC小鼠的治疗作用。3.2汉黄芩苷对UC小鼠结肠巨噬细胞的影响对汉黄芩苷干预后的UC小鼠,取其结肠组织固定,制备石蜡切片,利用免疫组化的方法,以F4/80+染色标记结肠中的巨噬细胞,在显微镜下观察巨噬细胞分布的变化。3.3汉黄芩苷对UC小鼠结肠巨噬细胞NLRP3炎症小体的影响对汉黄芩苷干预后的UC小鼠,取其结肠制备冰冻切片,利用免疫荧光的方法,共定位F4/80+巨噬细胞和NLRP3、F4/80+巨噬细胞和Caspase-1,检测UC小鼠结肠巨噬细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白的变化,分析NLRP3炎症小体在巨噬细胞中形成情况。采用ELISA检测结肠组织上清中NLRP3炎症小体下游效应分子IL-1β和IL-18的分泌情况。3.4汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞活性的影响利用LPS刺激的RAW264.7细胞经典炎症模型,汉黄芩苷干预后,采用MTT法检测汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞活性的影响,筛选出实验剂量;采用流式细胞仪检测汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞荧光微球吞噬率的影响。3.5汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞TXNIP、iNOS及p-p65蛋白的影响以LPS刺激的RAW264.7细胞经典炎症模型为研究对象,汉黄芩苷预先与RAW264.7细胞孵育2h,然后加入LPS刺激24h,收集细胞、提取细胞浆蛋白,采用蛋白免疫印迹法检测胞浆中TXNIP、iNOS蛋白表达量的变化。LPS刺激1h,提取蛋白,检测磷酸化p65（Phosphorylation of p65,p-p65）的表达情况。3.6汉黄芩苷对TXNIP-NF-κB-iNOS信号通路的效用分子NO、TNF-α的影响按上述3.5项下方法处理细胞,收集细胞上清,采用NO检测试剂盒检测上清中NO分泌量,CBA试剂盒检测上清中细胞因子TNF-α的变化。3.7汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体形成的影响按上述3.5项下方法处理细胞,采用激光共聚焦显微镜检测RAW264.7细胞中NLRP3和ASC、NLRP3和Caspase-1共定位的情况,分析汉黄芩苷对RAW264.7细胞中NLRP3炎症小体形成的影响。3.8汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体活化的影响按上述3.5项下方法处理细胞,收集细胞,提取胞浆蛋白,检测胞浆蛋白中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达情况。45KD的pro-Caspase-1与17KD的cle-Caspase-1的比值是反映NLRP3炎症小体活化的指标。结果:1.黄芩汤对DSS诱导的UC小鼠的治疗作用小鼠经3%DSS造模后,出现体重下降、毛色暗沉、蜷缩少动、粪便由硬变稀并且后期出现明显的血便的症状。与正常组比较,模型组小鼠结肠红肿变短,结肠部分上皮层出现明显脱落,肠腺不完整和黏膜肿胀增厚的现象。外周血中单核细胞和中性粒细胞的比例明显升高（P<0.01或P<0.001）。与模型组比较,柳氮磺吡啶和黄芩汤各剂量组小鼠上述指标都有不同程度的恢复。其中黄芩汤干预后,UC小鼠体重下降呈现减缓的趋势（P<0.05）,且结肠上皮结构相对完整,黏膜水肿现象消失;中剂量及高剂量组小鼠外周血单核细胞和中性粒细胞占白细胞的比例下降（P<0.01）。结肠组织中巨噬细胞明显减少。2.黄芩汤各主要单体成分在各个组织中的分布采用高分辨率四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）研究黄芩汤中主要活性成分（黄芩苷、甘草苷、甘草酸和芍药苷）在组织（心脏、肝脏、肾脏和结肠）的分布情况,通过Multiquent软件分析发现在心脏、肝脏和肾脏中汉黄芩苷含量高于其他四种单体化合物（黄芩苷、甘草苷、甘草酸和芍药苷）;在结肠组织中黄芩苷含量最高,汉黄芩苷其次,但是汉黄芩苷在结肠组织中的吸收率（结肠组织单体含量与汤中含量的比值）最高。3.汉黄芩苷通过影响NLRP3炎症小体而发挥治疗UC的作用3.1汉黄芩苷对DSS诱导的UC小鼠的治疗作用实验第1～10天,与正常组相比,模型组小鼠体重在第6天开始明显下降（P<0.001）;与模型组相比,汉黄芩苷高、中、低剂量组下降明显减缓,恢复明显（P<0.05）。与正常组相比,模型组小鼠结肠明显变短（P<0.001）,粪便呈现出稀状,并且有恶臭味。与模型组相比,汉黄芩苷低剂量（P<0.01）和汉黄芩苷中剂量组（P<0.05）结肠明显更长。比正常组相比,模型组小鼠的脾脏指数明显升高（P<0.001）,外周血白细胞数目比例也明显升高（P<0.001）,各给药组降低,其中单核细胞在外周血白细胞的比例下降得最明显（P<0.001）。HE染色结果显示正常组结肠固有腺体完好,模型组小鼠显示结肠溃疡面形成,固有腺体消失,黏膜有轻微水肿增厚,上皮细胞坏死脱落,组织学评分高（P<0.001）,而各给药组小鼠组织形态以及病理变化情况有所改善,尤其是汉黄芩苷中剂量与高剂量组（P<0.01）。3.2汉黄芩苷对UC小鼠结肠组织巨噬细胞的影响通过免疫组化法检测到结肠中巨噬细胞（F4/80+）的分布,模型组小鼠棕色颗粒大多分布在结肠组织固有层和黏膜下层,与正常组比较明显增加（P<0.001）,汉黄芩苷干预后巨噬细胞在结肠中含量有所减少（P<0.05）。3.3汉黄芩苷对UC小鼠结肠组织NLRP3炎症小体的影响通过激光共聚焦显微镜（Confocal）检测小鼠结肠巨噬细胞和NLRP3炎症小体蛋白共定位的变化,实验结果表明:与正常组相比,模型组小鼠红色和绿色荧光共定位明显增强,与模型组比较,给药组小鼠结肠巨噬细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表达降低。与正常组相比,模型组结肠组织匀浆中NLRP3炎症小体下游效应分子IL-1β和IL-18的含量明显增加（P<0.01）,汉黄芩苷能减少结肠组织中IL-1β和IL-18的分泌量（P<0.05）。3.4汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞活性的影响LPS刺激RAW264.7细胞后,细胞增殖速率减慢（P<0.05）,而汉黄芩苷剂量（12.5μM、25μM、50μM）时对细胞有一定的保护作用（P<0.001）。与正常组相比,模型组巨噬细胞吞噬荧光微球的数量增加（P<0.05）,与模型组相比,汉黄芩苷能明显降低细胞吞噬荧光微球的数量（P<0.01）。3.5汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞TXNIP、iNOS和p-p65蛋白的影响LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型中,通过检测各组细胞胞浆蛋白中TXNIP和iNOS表达情况发现,与正常组相比,模型组胞浆蛋白TXNIP含量明显降低（P<0.05）,汉黄芩苷干预组以剂量依赖性的方式恢复至正常水平的作用（P<0.05或P<0.01）。但是从胞浆中iNOS蛋白表达的变化可以看出,与正常组相比,模型组中iNOS蛋白表达明显升高（P<0.001）,汉黄芩苷干预组以剂量依赖性的方式降低蛋白的表达（P<0.01或P<0.001）,也使其恢复至正常水平。LPS刺激1h后,细胞浆中p65磷酸化水平明显升高,药物高剂量和中剂量组有所降低（P<0.05）。3.6汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞NO及TNF-α的影响与正常组相比,模型组NO及TNF-α分泌明显升高,汉黄芩苷以剂量依赖性的方式抑制NO的分泌（P<0.01）,并且抑制细胞因子TNF-α的分泌,尤其高剂量组抑制作用明显（P<0.01）。3.7汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体形成的影响当Caspase-1和NLRP3蛋白发生共定位时,红色和绿色荧光共定位出黄色荧光。与正常组相比,模型组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白共定位表达明显增强（P<0.001）,表现出黄色荧光更强,汉黄芩苷干预组黄色荧光的强度明显减弱（P<0.05或P<0.01）。NLRP3和ASC蛋白共定位也是类似的现象。3.8汉黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7细胞NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达的影响与正常组比较,模型组细胞胞浆中NLRP3蛋白表达明显增加（P<0.001）,药物干预组以剂量依赖性的方式降低NLRP3蛋白的表达（P<0.01或P<0.001）。ASC表达在各组之间不变,但蛋白分子量位置发生变化。当用分子量为17KD活化的Caspase-1片段的灰度值比上45KD pro-Caspase-1灰度值时,模型组比值明显增大,差异有统计学意义（P<0.001）,药物干预组比值明显降低,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论:1.黄芩汤对DSS诱导的UC小鼠有一定的治疗作用;2.黄芩汤中的主要成分黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、甘草苷和芍药苷在UC小鼠各组织中均能检出,其中汉黄芩苷在结肠组织中含量很高;3.汉黄芩苷对DSS诱导的UC小鼠有一定的治疗作用,其作用机制与干预巨噬细胞中“TXNIP-NFκB-NLRP3”炎症信号通路进而影响NLRP3炎症小体的形成和活化有关。