研究背景我国近年来糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）发病率和患病率一直表现出上升趋势。早期DKD即可见白蛋白尿,与肾小球滤过屏障受损相关,而足细胞是滤过屏障的主要组成成分,足细胞形态功能及数量的减少参与了DKD的发生发展,且足细胞一旦死亡,无法再生,而细胞自噬可以维持细胞稳态,避免细胞死亡,这提示调节自噬很可能是保护足细胞的治疗靶点之一。芍药苷（Paeoniflorin,PF）是从经典草药芍药中提取的主要活性成分。PF毒副作用低,对机体多种主要脏器具有保护作用,在医学研究中受到了广泛关注。在急慢性肾脏疾病动物模型中,PF均表现出现明显的肾脏保护作用。我们课题组在前期研究中也发现PF可以改善糖尿病小鼠的尿白蛋白排泄和肾脏病理性改变,包括基底膜增厚,足突融合,系膜区增宽。但遗憾的是,研究焦点局限在肾间质的巨噬细胞中,而对于PF防治足细胞功能障碍,特别是在早期DKD的具体作用机制仍有待进一步地研究。本研究旨在观察PF对DKD中的足细胞损伤的保护以及对足细胞自噬和凋亡的影响,通过计算机网络预测寻找药物靶点入手来深入探讨药物对DKD足细胞的具体作用机制,为PF应用于DKD治疗提供有力的科学依据。方法:第一部分:本研究选择人DKD肾穿刺标本测序的数据集GSE30122,对其中包含的肾小球RNA-seq数据（GSE30528）和包含肾小管RNA-seq数据的（GSE30529）分别分析以观察细胞死亡相关的基因在肾组织的分布情况,并筛选出KEGG或GO富集到的最为显著的细胞死亡相关通路进一步进行临床观察。之后我们收集我院经由肾活检确诊为DKD的患者临床和病理资料,同时收集了不伴有糖尿病和肾功能异常的肾癌患者癌旁肾组织以及不伴有糖尿病的微小病变（minimal change disease,MCD）患者作为非DKD对照组（分别是无蛋白尿的正常对照组和大量蛋白尿对照组）。将入组患者分为,癌旁肾的NC组,MCD组,DKD患者中尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio,ACR）为30-299 mg/g者为DKD1组,尿白蛋白/肌酐比值≥300 mg/g为DKD2组。排除组间临床基线资料的差异后观察各组间肾小球上的目标细胞死亡形式的标志物的变化差异,评价该细胞死亡形式在DKD的存在是否有特异性。同时对DKD的两个亚组进行临床病理资料分析,将差异指标及目标细胞死亡形式的标志物蛋白表达纳入到逐步回归法及二元Logistic回归分析提取并评价关键影响因素的临床意义。最后进行ROC曲线分析评价影响因素在DKD进程中的诊断意义。第二部分:对PF进行药代动力学观察。因PF生物利用度较低,所以我们改为腹腔注射给药。首先构建PF腹腔给药和静脉给药的大鼠模型,后按时间点取静脉血进行质谱检测PF的血药浓度变化,并计算出PF的生物利用度。其次构建PF腹腔给药的小鼠模型,按时间点取血和肾组织,通过质谱检测PF浓度,观察PF在肾组织的分布变化。第三部分:建立STZ诱导的糖尿病小鼠模型,并给予PF治疗后取血、尿和肾组织样本,通过生理指标、血尿生化指标,和肾脏病理检查观察PF对DKD的肾脏保护作用。通过电镜、免疫组化和免疫印迹方法检测体内外实验中足细胞数量及功能的标志蛋白评价PF对足细胞的保护作用。通过对体内外实验中目标死亡形式标志性蛋白的免疫组化、免疫荧光、免疫印迹及TUNEL实验等观察PF对目标死亡形式的影响。依据PF的分子式通过网络计算机对PF的作用靶点蛋白进行预测,并通过分子对接、热位移实验（CESTA）以及表面等离子共振（SPR）等进行验证,之后通过String网站,寻找靶点的互作蛋白,并通过免疫共沉淀进行验证。最后体外si RNA敲低足细胞内的靶标蛋白来观察PF对足细胞内下游信号通路以及存活的影响,从而验证PF是通过靶标蛋白发挥作用的。结果:第一部分DKD病人肾组织中的自噬活性变化及其临床意义分析本部分研究首先从生物信息学分析入手。我们发现自噬活化和调控相关的基因在肾小球上比在肾小管间质中表现出更为显著的改变,这提示在DKD进展过程中自噬的改变可能是以肾小球为主。肾小球的差异基因除了富集在免疫细胞,氧化应激,补体及凝集素,细胞外基质分泌以及多条信号通路（如Ras、PI3K/AKT、Wnt信号通路）以外,还存在大量与自噬活化和调控相关的基因发生变化。而在肾小管间质中,主要是与调控免疫细胞相关的基因发生改变。因此本研究的重点聚焦在肾小球的自噬活性,并将P62的蛋白表达作为衡量自噬活性的标志物。DKD患者各组间的临床资料分析结果提示生化指标的差异主要体现在脂代谢上,如总胆固醇（CHO）、低密度脂蛋白（LDL）、载脂蛋白B（Apo B）,载脂蛋白A1（Apo A1）在伴有大量蛋白尿的DKD患者中明显升高,而尿液中的U-TRF、U-Ig G、U-NAG、u-ALB/Cr、U-TP/Cr以及尿总蛋白和白蛋白的排泄量均明显升高。病理资料中肾小球病变程度、IFTA、间质炎症,及动脉硬化程度明显加重,而动脉玻璃样变各组间差异无统计学意义。免疫组化结果表明了与NC组和MCD组相比,DKD患者肾小球中P62蛋白水平明显升高,且在伴有大量蛋白尿的DKD患者中表达水平最高。而NC组与MCD组比较,P62蛋白表达无显著差异。选取DKD患者的肾组织进行P62和WT-1的免疫荧光双染,结果提示肾小球中存在于大量P62+/WT-1+阳性细胞,而系膜细胞和内皮细胞上的P62显色较少,提示DKD进展过程中出现的自噬抑制主要是在足细胞上存在。P62与临床病理资料的相关性分析结果表明肾小球中的P62蛋白水平分别与血清CHO、HDL、LDL、Apo A1、Apo B,尿液中的TRF、Ig G、ALB/Cr、TP/Cr以及肾小球损伤、间质炎症呈正相关,而与血清ALB和U-Cr改变呈负相关。逐步回归法分析法筛选出Apo A1和肾小球上的P62蛋白表达与DKD的白蛋白尿进展相关。而logistic回归结果提示仅有P62的p＜0.05。ROC曲线分析结果是,肾小球上的P62蛋白表达在白蛋白尿分期的诊断准确度为0.967,特异性为0.709,AUC为0.905.第二部分PF的药代动力学特点从血药浓度变化曲线上看,PF腹腔注射后在体内的血药浓度峰值是在5 min以内,提示经腹腔注射药物吸收速度非常快,之后迅速下降,于8 h之后逐渐稳定并缓慢进行性下降。这提示PF可能出现快速代谢或排泄,或者从血液中快速分布到各个组织器官中。PF的生物利用度为32.9%,与之前文献中提及的口服生物利用度明显升高。另外腹腔注射PF后30 min肾脏的药物浓度就远远高于血药浓度,之后持续存在近24 h,肾脏药物浓度是血药浓度的7.8-33.9倍,这一结果表明PF在吸收后快速分布到组织器官中,而肾脏浓度始终高于血药浓度,提示肾脏是PF的主要药理学靶器官和排泄器官。第三部分PF能够通过VEGFR2介导的PI3K/AKT信号通路来调控足细胞自噬和凋亡为了评价PF对DKD的影响,我们首先建立了STZ诱导的糖尿病小鼠模型,并检测了3种不同剂量（50/100/200 mg/kg）的PF对小鼠的生理生化指标的影响。DKD组24 h尿量和白蛋白排泄量明显高于NC组,而PF给药组12周时尿量低于DKD组小鼠,其他肝功能,肾功能,以及血糖,PF给药组和DKD组无差异。肾脏病理分析结果提示;与NC组比较,DKD组肾小球系膜基质面积明显增宽,肾小球体积增大,而PF治疗后缓解。电镜检查结果提示:与NC组相比,DKD组GBM明显增厚,足突绝大部分融合,而PF给药后上述病理改变明显恢复。免疫印迹和免疫组化结果表明,与NC组相比,DKD组足细胞标志物WT-1和足细胞功能标志物nephrin蛋白表达水平明显下降,提示DKD中足细胞的数量及功能均有下降,这与课题组之前观察到的结论是一致的。而从PF组中WT-1和nephrin表达水平的升高可以看出,PF的治疗能够减轻DKD中的足细胞数量减少和功能受损。在体外培养的足细胞中,MTT实验观察到高糖刺激48 h后足细胞的增殖逐渐减慢,而PF能改善体外足细胞增殖抑制。足细胞标志物以及功能蛋白（WT-1和nephrin）蛋白表达水平在HG刺激后显著降低,而经PF处理后升高。在足细胞粘附和迁移方面,高糖刺激能诱使足细胞粘附和迁移能力明显降低,而PF则部分恢复了足细胞粘附和迁移功能。以上均提示在体外培养中,PF能改善高糖刺激导致的足细胞增殖抑制和足细胞功能损伤。在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中,免疫荧光双染提示:与NC组相比,DKD组P62+/WT1+细胞增多,提示足细胞损伤过程中存在自噬缺失,而经过PF处理后P62+/WT-1+减少。电镜下观察到,对照组足细胞中存在典型的双膜结构的自噬体,而DKD小鼠足细胞中自噬体数量急剧减少,PF处理后自噬体明显增多。免疫印迹结果提示:与NC组相比,DKD组的Beclin-1、ATG5、ATG7蛋白表达水平和LC3 II/I比值下降,P62蛋白表达增强,而PF给药部分逆转了这一改变。TUNEL染色和cleaved-caspase 3、synaptopodin的免疫荧光双染色显示,与NC组相比,DKD组肾小球足细胞凋亡明显升高,而PF处理后也可明显抑制足细胞凋亡,这与WB和IHC检测的cleaved-caspase 3蛋白表达改变是一致的。体外实验中,我们也观察到PF能够改善高糖刺激下的足细胞自噬抑制和凋亡激活。另外使用自噬抑制剂处理足细胞后,PF无法发挥对高糖刺激的足细胞损伤的保护作用,由此推断,PF通过提高自噬通量而发挥对高糖诱导足细胞损伤的保护作用。接下来,通过计算机网络预测发现PF在足细胞上作用靶点可能是血管内皮生长因子受体（VEGFR）,通过观察该蛋白在组织的表达变化,热位移实验,并结合既往文献,确定PF在足细胞上作用靶点为血管内皮生长因子2（VEGFR2）。分子对接和SPR验证了PF在体外能够与VEGFR2直接结合。体内实验证实肾组织上的VEGFR2以及VEGFR2的磷酸化在PF给药后比DKD组明显下降。通过String网站预测结合免疫共沉淀实验证实了VEGFR2直接结合PIK3CA,同时在体内外模型中也观察到PF能调节PI3K/AKT信号通路的磷酸化。之后使用si RNA沉默足细胞上的VEGFR2,观察到高糖诱导的自噬抑制和凋亡活化有所改善,而PF处理后未呈现出明显的叠加作用,提示PF是通过VEGFR2调控PI3K/AKT信号通路进而调控足细胞自噬和凋亡的。结论:1.在DKD中,自噬的抑制主要表现在DKD进展期的肾小球足细胞上。自噬活性标志物P62在肾小球上的表达变化可能用于DKD进展至大量蛋白尿期的预测因素。2.腹腔注射给药方式能提高PF的生物利用度,并且PF进入机体后能富集到肾组织,提示肾脏是该药靶标器官的可能性较大。3.PF直接结合VEGFR2,通过影响下游的PI3K/AKT信号通路进而调控足细胞的自噬和凋亡,最终发挥肾脏保护作用。