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绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为基因表达和蛋白定位的荧光标记物，主要应用于真核生物和细菌细胞和分子生物学研究中。大多数古菌生活在恶劣的环境中。其中，冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus的最适生活条件是75-80℃、pH2-3。大多数GFP因高温强酸条件下易失活变性而无法应用于S.islandicus中。在许多GFP突变体中，eCGP123(enhanced consensus green proteinvariant123)具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等性质，已经用于研究S.acidocaldarius细胞表面不同Ⅳ型菌毛结构缺失突变体对细胞膜形成的影响。但是，eCGP123能否应用于古菌蛋白的细胞定位中，这个问题还有待解决。 ATPase/解旋酶HerA(SiRe_0064)和核酸酶NurA(SiRe_0061)是参与S.islandicus中DNA双链断裂（double-stranded breaks，DSBs）修复的重要蛋白，能够对dsDNA进行切割，与Mre11-Rad50复合物协同作用，最后产生3-overhang底物。She等人以及实验室尝试敲除S.islandicus同一个操纵子中的mre11、rad50、herA和nurA这四个基因，但都没有得到缺失突变体，说明它们对细胞的生存是必需的。除了经典的herA-nurA基因外，S.islandicus基因组中还存在多个herA-nurA同系物基因。其中，herA同系物基因包括SiRe_0017、SiRe_0095、SiRe_0566、SiRe_0581和SiRe_1531; nurA同系物基因包括SiRe_0014、SiRe_0094、SiRe_0565、SiRe_0582和SiRe_1533。这些基因总是成对出现，目前尚不清楚它们在体内的必需性和功能。 本研究中，为了研究eCGP123在S.islandicus活细胞中作为报告基因对蛋白进行细胞定位的可行性以及herA-nurA同系物基因必需性，利用S.islandicus中比较完善的遗传操作体系，构建eCGP123融合蛋白过表达菌株和herA-nurA同系物基因敲除菌株，测定菌株生长曲线，分析细胞表型以及显微观察进行蛋白的细胞定位等实验。 首先，优化与合成了eCGP123基因。在E.coli中，表达和纯化得到eCGP123,它具有较高的热稳定性，表达细胞均产生绿色荧光。同时，在S.islandicus中表达了eCGP123及其融合蛋白eCGP123-lacS，表明eCGP123具有较高的热稳定性和耐酸性，为S.islandicus中蛋白的细胞定位奠定了基础。 随后，在eCGP123的C-末端分别融合了E.coli和S.islandicus中的功能蛋白，研究其在蛋白细胞定位中的可行性。在E.coli中，通过eCGP123对微管同源蛋白FtsZ进行定位，观察到eCGP123-FtsZ的荧光主要分布在细胞的中间，达到了预期结果。eCGP123在S.islandicus中单独表达时，荧光均匀分布于细胞中;与定位于细胞膜上的分泌型ATP酶UpsE融合后，荧光也呈均匀分布，但难以判断其定位。当eCGP123与PCNA亚基PCNA1融合时，可以在少数细胞中观察到1-4个PCNA1 foci。本底表达的SiRe1200-C-His能够通过eCGP123定位于细胞中间，进一步表明其参与细胞分裂。能够观察到eCGP123-SiRe_1388-no-His的荧光分布在细胞中间并环绕在细胞周围，因此，SiRe_1388可能参与细胞的分裂，定位于细胞膜上。eCGP123-SiRe_1550的荧光集中在细胞的某一个区域，无法判断其定位。通过细胞表型分析和生长曲线测定，发现，eCGP123影响了SiRe_1200、SiRe_1388和SiRe_1550等蛋白过表达细胞的生长，出现大细胞。总体而言，在S.islandicus中，eCGP123具有一定的蛋白定位功能，但其荧光较弱，易淬灭，融合蛋白的过表达可能会影响细胞的生长，而且蛋白的定位受到融合蛋白表达水平的干扰，再加上细胞直径较小(直径1-2μm)，因此，对蛋白的定位造成一定的困难。 另一方面，采用等位置换的敲除策略，尝试对位置上较近的herA-nurA同系物基因进行双敲，分析了它们的必需性。通过MCSV平板筛选，只得到SiRe_0014-SiRe_0017、SiRe_0094-SiRe_0095、SiRe_0581-SiRe_0582和SiRe_1531-SiRe_1533等双敲除菌株，而且它们在细胞生长和形态上与对照菌株没有明显的差异，说明它们是非必需基因。但是，没有得到△SiRe_0565-SiRe_0566敲除菌株，暗示了SiRe_0565-SiRe_0566基因对细胞生长的重要性，很可能是必需基因。