增殖型腺病毒又称条件复制型腺病毒或溶瘤病毒，可利用肿瘤细胞与正常组织细胞间结构及代谢途径的差异，靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖，最终裂解肿瘤细胞，同时能长效表达抗肿瘤的外源基因[1]。常用的5型增殖型腺病毒具有可复制、体积小、弥散能力强等优点，但也存在感染效率不高及毒副作用强等问题。人11型腺病毒(Ad11)属于B2亚群，与传统的5型等C组腺病毒载体相比有许多优点：血清中的中和抗体阳性率较低；与5型腺病毒(Ad5)无免疫交叉反应；感染细胞不依赖CAR受体，能够高效感染多种重要的干细胞及原代肿瘤细胞；肝脏毒性低，免疫副作用小等[2-3]。用11血清型腺病毒纤毛蛋白的knob和shaft替换传统5型腺病毒载体纤毛蛋白的knob和shaft，构建成的具有嵌合型纤毛蛋白的Ad5/F11腺病毒载体，继承了Ad11的感染特性，能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞，尤其是对肿瘤细胞及造血干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率[2-3]。　　 趋化因子是一类在细胞的生理过程中发挥着重要作用的细胞因子样蛋白质，可趋化白细胞和免疫细胞向组织浸润[4-5]。趋化因子在肿瘤生物学中具有较复杂的作用和重要意义，将趋化因子导入肿瘤组织，能强化宿主抗肿瘤免疫反应[6-7]。NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，英文全称为”natura.kille.cell”，也称作”自然杀伤细胞”，它属于一种能直接杀伤靶细胞效应的特殊的淋巴细胞系，具有抗肿瘤抗感染免疫调节的功能，且表现为速发效应。趋化因子借助NK细胞参与抗肿瘤免疫的环节大致为：吸引外周血NK细胞(该部位趋化因子浓度低)浸润肿瘤部位，促进NK细胞与肿瘤细胞结合，这种结合使得大量趋化因子瞬间释放出来，形成局部高浓度区域，不仅增强了NK的溶细胞作用，还可趋化大量NK细胞、T细胞、单核细胞不断进入肿瘤局部；NK细胞分泌的多种无ELR的趋化因子破坏了肿瘤的微血管系统，导致其他效应细胞和细胞毒分子渗出到肿瘤组织，引起肿瘤的出血坏死[8]。　　 趋化因子CCL5也称为RANTES，是受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulate.upo.activatio.norma cel.expresse.an.secrete.factor.RANTES)，是趋化性细胞因子CC亚族成员(CCL5)。其来源广泛，多数组织在炎性因子IL-1β或TNF-α的刺激下可释放RANTES，RANTES由CD8+T细胞、上皮细胞、成纤维细胞和血小板分泌。病毒感染可引起某些细胞RANTES的表达升高，如呼吸道合胞病毒感染可引起人鼻粘膜及腺样上皮细胞RANTES的表达升高；流感病毒感染可诱导人支气管组织和鼻息肉的上皮细胞表达RANTES；某些肿瘤细胞在一定的条件下也可表达RANTES，如伤寒沙门氏菌感染或细胞因子可刺激HT-29、Caco-2细胞表达RANTES。RANTES对多种白细胞如T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞具有趋化或刺激作用。其特异性受体属7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR类)，包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5。现认为，RANTES对白细胞的趋化作用依赖于RANTES与GAG的结合，GAG位于细胞外基质和内皮细胞表面[9]。因此RANTES的聚集能增强其趋化作用，可能是通过提高局部的RANTES浓度，使得吸引细胞所经路径形成RANTES的浓度梯度。近年来，RANTES基因在肿瘤的发生、发展和转归中的作用被陆续发现[10]，认为该基因在肿瘤免疫治疗方面具有潜力，逐渐成为新的研究热点。.基于以上研究根据，本研究构建了携带ccl5基因以及氧依赖性蛋白降解结构域基因odd的Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD，希望利用Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒更强的肿瘤感染能力与杀伤作用，在肿瘤内部缺氧环境下特异性表达CCL5，提高携带ccl5基因的腺病毒的肿瘤杀伤能力。不仅如此，趋化因子CCL5也将趋化更多的淋巴细胞，尤其是T细胞进行细胞杀伤作用。并且我们将在体内实验中验证趋化因子在肿瘤部位表达后对NK细胞的趋化能力，诱导更多的NK细胞靶向杀伤肿瘤细胞，运用机体自身的免疫反应对肿瘤进行消除。　　 .Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD的构建　　 在前期实验中，已经通过分子生物学技术将Ad.fiber的knob和shaft替换为Adl.fiber的knob和shaft，构建嵌合型Ad5/F11腺病毒骨架质粒SG511。将携带ccl5基因及缺氧调控基因ODD的穿梭质粒pPE3-F11B-CCL5-ODD与5型腺病毒骨架质粒pSG502(CNHK500病毒的穿梭质粒)通过Lipofectamin.2000共转染至293细胞。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA并应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的腺病毒命名为SG511-CCL5-ODD；同时重组出Ad5/F11嵌合型非增殖腺病毒AD5/11-CCL5-ODD与Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD。将重组出的病毒在293细胞中反复大量扩增，通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化，并用TCID50法测得重组腺病毒SG511-CCL5-ODD的滴度达到2.79×1010pf./ml。　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治疗肝癌的体外实验　　 增殖实验表明SG511-CCL5-ODD能在肝癌细胞HepG2与Hep3B内大量复制，在正常细胞内复制扩增却很弱；通过ELISA实验确定SG511-CCL5-ODD能高效感染肝癌细胞HepG2与Hep3B并在缺氧条件下大量表达CCL5；将SG511-CCL5-ODD感染后的Hep3B细胞上清对NK92细胞进行趋化实验证实CCL5蛋白的活性，并证实CCL5对NK92细胞具有良好的趋化效应。将增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD、非增殖型腺病毒AD5/11-CCL5-ODD感染细胞，通过MTT实验评价细胞存活率并进行病毒的肝癌杀伤作用比较。一系列体外实验结果表明SG511-CCL5-ODD对肝癌有很强的感染能力与肿瘤杀伤作用，安全性良好。　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治疗肝癌的体内实验　　 将BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞悬液，建立肝癌动物模型。将动物随机分为4组，分别瘤内注射PBS、SG511-CCL5-ODD、AD5/11-CCL5-ODD、SG511治疗。自接种之日起，定期测量肿瘤体积；4周后将肿瘤组织取出，固定后制成石蜡病理切片。将肿瘤组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色，观察组织病变情况。体内实验结果说明，携带ccl5基因的Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD具有良好的体内抑瘤作用，能抑制肿瘤的发生发展，疗效优于PBS对照组、AD5/11-CCL5-ODD组和SG511组。　　 综上所述，我们构建了携带ccl5目的基因的Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD，其对肝癌的疗效明显强于传统病毒基因治疗，并且通过病理分析能发现，在肿瘤处有大量的细胞坏死。该方案充分发挥了病毒基因治疗的优势，为肝癌等实体肿瘤的治疗提供了一种新的思路。