背景肝窦阻塞综合征（HSOS）是一种严重的肝脏血管性疾病,病死率高。在国内,摄入含有吡咯生物碱（pyrrolizidine alkaloids,PAs）的植物是主要的病因,其中,以传统中草药土三七最为常见。野百合碱（MCT）是来自于豆科猪屎豆属植物的一种PAs,由MCT构建的大鼠HSOS病理改变与人类HSOS最为接近。有研究认为PAs在肝脏脱氢后形成强亲电子性的吡咯代谢物而产生肝毒性。活性吡咯代谢物与谷胱甘肽（GSH）结合生成吡咯并谷胱甘肽偶联物而被解毒;当GSH耗竭时,活性吡咯代谢物与蛋白质相互作用形成吡咯-蛋白质加合物（PPAs）,而PPAs被认为是PAs诱导HSOS的关键致病因子。最近研究表明,在PAs诱导的小鼠HSOS模型中,肠道菌群发生紊乱;用抗生素预处理肠道菌群后,显著改善HSOS损害,提示肠道菌群参与HSOS的发生发展。大量研究证实,微生物组成的改变会导致微生物相关代谢物的改变,比如色氨酸代谢等。目前,在循环中和肝脏中已经检测到多种微生物代谢产物,其中一些代谢产物（例如来自色氨酸微生物代谢产物的吲哚衍生物）是宿主受体的配体,如芳香烃受体（Ah R）。Ah R是一种配体依赖性转录因子,能够被色氨酸微生物代谢物激活。Ah R活化后可激活多种信号通路,其中包括Nrf2抗氧化应激通路的活化。研究表明Ah R在肝脏中高表达。此外,在HSOS鼠类模型中Nrf2活化受阻,肝脏氧化应激水平升高;活化Nrf2抗氧化通路后显著改善HSOS损害。然而,在MCT诱导的大鼠HSOS中,肠道菌群的构成以及微生物相关代谢物的表达谱尚无报道。此外,Ah R在HSOS中的表达,以及Ah R-Nrf2此抗氧化通路在HSOS的作用尚无研究。鉴于此,本文将对以上问题进行深入探讨。方法1探讨肠道菌群在MCT诱导的大鼠HSOS中的作用1.1评估MCT（90mg/kg）诱导的肝损害情况实验分组:（1）正常对照组;（2）HSOS模型组。MCT（90mg/kg）干预48h后,（1）收集肝脏标本,肉眼观察肝脏的大体形态,称量大鼠的体重以及肝重来评估肝脏淤血情况;（2）收集门静脉血清,ELISA法检测ALT和AST表达水平,评估肝细胞受损情况;（3）q RT-PCR以及western blot检测肝窦内皮细胞损害标志物基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达;（4）肝脏组织行H＆E染色,评估肝窦的扩张、出血,中央静脉内皮的损害,以及肝细胞凝固性坏死情况,计算HSOS严重度评分。1.2评估小剂量MCT诱导的肝损害情况分别采用小剂量MCT（45mg/kg、60mg/kg、75mg/kg）灌胃干预大鼠,48h后收集肝脏样本,检测指标同1.1。1.3粪菌移植HSOS粪便,观察其对MCT诱导的肝损害的影响用广谱抗生素混合物（ABX）灌胃大鼠预处理肠道菌群7天,构建肠道菌群清除模型。收集HSOS模型鼠（MCT 90mg/kg）粪便,制备粪便菌液,灌胃移植至肠道菌群清除模型中,每天1次,连续7天。再给予小剂量MCT干预（依照1.2实验结果）,48h后收集肝脏样本,检测指标同1.1。1.4粪菌移植正常大鼠粪便,观察其对MCT诱导的肝损害的影响收集正常大鼠粪便,制备粪便菌液,灌胃移植至小剂量MCT干预组大鼠,每天1次,连续5天,然后收集肝脏样本,检测指标同1.1。2检测MCT（90mg/kg）诱导的大鼠HSOS模型中肠道菌群构成的改变分别收集正常对照鼠和HSOS模型鼠粪便,进行肠道菌群16S r DNA测序。分别进行Rarefaction稀释曲线、α多样性分析分析（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）、ANOSIM相似性分析、以及β-多样性分析（PCA分析、PCo A分析）来评估MCT-HSOS大鼠肠道菌群组成的改变。进一步行KEGG代谢通路分析了解组间微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异。3检测MCT（90mg/kg）诱导的大鼠HSOS模型中粪便代谢组学的改变分别收集正常对照鼠和HSOS模型鼠粪便,进行基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-QEMS）的非靶向粪便代谢组学分析。分别对数据进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）、差异代谢物的筛选、和差异代谢物的代谢通路分析,来评估MCT-HSOS模型鼠微生物代谢谱的改变。4评估活化Ah R-Nrf2抗氧化通路对MCT-HSOS的影响4.1评估色氨酸微生物代谢物对MCT-HSOS的影响依据上述粪便代谢组学的结果,明确色氨酸代谢通路是否是差异代谢物之间最关键的代谢通路;同时,进一步筛选出那些代谢水平下降并且已被鉴定为Ah R配体的色氨酸代谢物,然后灌胃大鼠补充相关代谢产物,其后再接受MCT（90mg/kg）处理,48h后收集肝脏标本。检测指标同1.1。4.2评估AhR激动剂Ficz对MCT-HSOS的影响Ficz连续腹腔注射3天后,再给予90mg/kg MCT处理,48h后收集肝脏标本。检测指标同1.1。4.3肝脏氧化应激水平的检测ELISA法分别检测正常对照组、HSOS模型组、色氨酸微生物代谢物干预组、Ficz干预组中肝脏氧化应激水平,包括丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、GSH/GSSG比例、以及谷胱甘肽S-转硫酶（GST）。4.4 Ah R-Nrf2抗氧化通路检测4.4.1 AhR表达水平及活化检测q RT-PCR法检测各组中肝脏总Ah R的表达;提取肝脏核蛋白,western blot检测胞核水平Ah R的表达;q RT-PCR以及western blot检测Ah R活化指标CYP1A1的表达水平。4.4.2 Nrf2的表达水平及活化检测q RT-PCR法检测各组中肝脏总Nrf2的表达;提取肝脏核蛋白,western blot检测胞核水平Nrf2的表达,来评估Nrf2的活化情况。4.4.3 Nrf2下游抗氧化因子检测q RT-PCR法检测各组中肝脏GCLC、GCLM、NQO1、HO-1抗氧化因子的表达情况。结果1.在MCT（90mg/kg）诱导的大鼠HSOS模型中,存在严重肝损害:对比正常组,HSOS模型鼠（1）肝脏明显淤血、肿胀,肝重以及肝重/体重比明显升高;（2）模型组中ALT和AST水平显著升高;（3）肝脏组织HE结果显示,HSOS模型鼠存在肝窦的扩张、出血,中央静脉内皮损害,以及肝细胞凝固性坏死,HSOS严重度评分显著增加;同时,LSEC损伤标志物MMP-9的表达量明显升高。2.粪菌移植HSOS菌液,加重MCT（60mg/kg）诱导的肝损害:对比MCT60mg/kg诱导的肝损害,粪菌移植+MCT 60mg/kg的处理,显著加重肝损伤程度,ALT和AST明显升高,MMP-9表达增加,肝脏病理提示肝窦的扩张、出血,中央静脉内皮的损害,以及肝细胞凝固性坏死情况更加严重,HSOS严重度评分明显升高。3.粪菌移植正常大鼠菌液,缓解MCT（60mg/kg）诱导的肝损害:对比MCT 60mg/kg诱导的肝损害,MCT 60mg/kg+粪菌移植能够显著缓解肝损伤程度,ALT和AST明显下降,MMP-9表达下调,肝脏病理提示肝窦的扩张、出血,中央静脉内皮的损害,以及肝细胞凝固性坏死情况减轻,HSOS严重度评分明显减低。4.MCT（90mg/kg）诱导的HSOS中,存在肠道菌群紊乱:与正常对照组比较,模型组中（1）菌群α多样性明显下降;（2）β多样性提示HSOS模型鼠存在微生物群落构成改变。在门水平,MCT诱导显著降低大鼠厚壁菌门的相对丰度,增加拟杆菌门的相对丰度。在科水平,与正常对照组比较,HSOS模型组中来自厚壁菌门的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）下降,同时来自拟杆菌门的Muribaculaceae也降低;然而,拟杆菌门的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）显著增高。在属水平上,HSOS模型鼠中Alloprevotella属、Muribaculaceae属、Prevotellaceae属下降,重要的是那些能够代谢色氨酸的菌属,包括Bacteroides属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属、Clostridium属也降低;而Prevotella-1属和Prevotella-9属相对丰度显著升高。KEGG代谢通路预测提示包括色氨酸代谢在内的多种通路存在改变。5.肠道菌群紊乱显著降低色氨酸微生物代谢产物的表达水平:在差异代谢物的代谢通路分析中,色氨酸代谢通路在拓扑分析中的影响因子最大,同时富集分析的P值存在显著差异,提示色氨酸代谢是差异代谢物之间最关键的代谢通路。进一步分析差异代谢产物,我们发现多种色氨酸微生物代谢产物表达下降,包括吲哚乙醛（Indole-3-Acetaldehyde,IAAld）、吲哚乙酸（Indole Acetic Acid,IAA）、吲哚、吲哚丙酸、吲哚乙酰胺、吲哚甲醛、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚-3-羧酸。6.IAAld/IAA/Ficz能够活化AhR-Nrf2抗氧化通路,改善MCT（90mg/kg）诱导的肝损害:肠道补充IAAld或IAA,或Ficz腹腔干预后,能够显著缓解MCT诱导的肝脏氧化应激损伤,降低MDA和ROS的表达水平,提高GSH/GSSG比例,增加GST的活性。显著改善肝脏淤血情况,降低肝重以及肝重/体重比;逆转升高的ALT和AST,缓解HSOS病理组织学损伤。IAAld、IAA、或Ficz能够活化肝脏Ah R,促进Ah R的核转移;同时,促进Nrf2的核转移,增加下游抗氧化因子GCLC、GCLM、NQO1的表达。结论肠道菌群参与HSOS的发生发展。IAAld、IAA或Ficz能够活化肝脏Ah R-Nrf2抗氧化通路,缓解HSOS中肝脏氧化应激水平从而改善肝损害。临床上,调节肠道菌群,补充Ah R配体可能是HSOS的新的治疗手段。