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棉花是重要的经济作物,能够为纺织工业提供纺织纤维。棉纤维从胚珠外表皮细胞发育而来,其发育过程包括纤维细胞起始、延伸、次生壁合成、以及纤维成熟4个彼此重叠的时期。依据花发育的“ABCDE”模型,C-,D-lineage基因属于AG-subfamily类转录因子并调控胚珠和子房发育,这两种花器官均是构成棉花纤维产量的决定因素。纤维发育过程是一个涉及剑众多基因作用的复杂过程,尽管人们对纤维发育机制还不完全清楚,但一系列与棉纤维发育相关转录因子已经被分离出来,其中MYB类转录因子对人们揭开纤维发育机制起重要作用。基于AG-subfamily和MYB类转录因子在纤维发育中的重要性,从胚珠绢织中克隆并分析这两类转录因了有望为利用分子育种技术提高棉花产量和质量提供候选基因。
通过RACE策略从+3 DPA时期的胚珠组织中共分离到2个AG-subfamily转录因子和3个MYB类转录因子的全长cDNA,分别命名为GbAGL1(登录号:FJ198049)、GbAGL2(臀录号:FJ198050)、GbMYB1(瞀录号:FJ198051)、G6MYB2(登录号:FJ198052)和GbMYB3(登录号:FJ198053)。进而通过Southern杂交、RT-PCR、RNA原位杂交、实时定量PCR、转基因拟南芥研究了这些基因的特征和表达模式。
GbAGL1基因cDNA全长为951bp,包括1个长度为672 bp的ORF,1个长度为67 bp的5’端非翻译区和1个长度为212 bp的3’非翻译区,编码1个由223个氨基酸组成的多肽(蛋白序列号:AC123560),分子量为25.72 kDa,等电点pI为9.44。GbAGL1基因蛋白包括1个MADS-box(2-56)、1个K-box(91-157)和2个AGmotifs,即AG motifⅠ(194-206)和AG motifⅡ(211-223)。GbAGL1基因和D-lineages高度同源,表明该基因是D-lineage基因,可能和胚珠发育有关。Southernblot分析表明该基因在海岛棉中以低拷贝形式存在。RT-PCR分析表明GbAGL1基因在胚珠组织中高水平表达,但在根、茎和叶等部位表达很低,并且从-3 DPA到+8 DPA时期的转录信号有规律地逐渐增强。RNA in situ hybridization结果显示GbAGL1基因在整个花芽原基、胚珠外表皮和纤维部位高水平转录。GbAGL1在转基因拟南芥中的超表达分析显示,GbAGL1基因和其它D-lineage基因具有类似功能,改变了拟南芥花器官发育表型。这些结果表明GbAGL1基因和胚珠发育有关,可能在纤维发育中起作用。
GbAGL2基因cDNA全长为1098 bp,包括1个长度为735 bp的ORF,1个长度为110 bp的5’端非翻详区和1个长度为252 bp的3’非翻译区,编码1个由244个氨基酸组成的多肽(蛋白序列号:AC123561),分子量为28.12 kDa,等电点pI为9.34。GbAGL2基因蛋白包括1个MADS-box(17-71)、1个K-box(105-171)和2个AGmotifs,即AG motifⅠ(214-226)和AG motifⅡ(232-244)。GbAGL2基因和C-lineages高度同源,表明该基因是C-lineage基因,可能和心皮发育有关。Southernblot分析表明该基因存海岛棉中以低拷贝形式存在。RT-PCR结果分析表明GbAGL2基因在胚珠内表达,在根、茎和叶等部位表达相对较低。RNA in situ hybridization结果显示GbAGL2基因在心皮原基、胚珠外表皮和纤维细织中均高水平表达。GbAGL2在转基因拟南芥中的超表达分析显示,GbAGL2基因和其它的C-lineage基因具有类似功能,改变了拟南芥花器官表型。这些结果表明GbAGL2基因和心皮发育有关,可能在纤维发育中有提高纤维产量的作用。
GbMYB1基因cDNA全K为974 bp,包括1个长度为765 bp的ORF,1个长度为66 bp的5’端非翻译区和1个长度为143 bp的3‘非翻译区,编码1个由254个氨基酸组成的多肽(蛋白序列号:ACI23562),分子量为29.07 kDa,等电点pI为6.25。GbMYB1基因蛋白包含2个MYB重复序列(14-61,67-112)。GbMYB1和R2R3-MYB类蛋白高度同源,表明该基因属于R2R3-MYB类型基因,可能在海岛棉中和纤维发育有关。Southern blot分析表明该基因在海岛棉中以低拷贝形式存在。RT-PCR分析表明GbAGL1基因在胚珠组织中均高水平表达,但在根、茎和叶等部位表达很低,并且从-3 DPA到+8 DPA时期的转录信号有规律地逐渐增强。Real-timePCR结果和RT-PCR结果一致,GbMYB1基因在徐州-142(wt)胚珠中的表达量(ΔCT值)高于在徐州-142无絮突变体(fl)中的表达量。RNA in situ hybridization结果显示GbMYB1基因在胚珠外表皮和纤维部位高水平转录。GbMYB1基因存转基因拟南芥中的过量表达使其表型发生了改变,如叶片变窄、矮化、根系核果长度有所缩短等。
GbMYB2基因cDNA全长为979 bp,包括1个长度为747 bp的ORF,1个长度为163 bp的5’端非翻译区和1个长度为72 bp的3’非翻译区,编码1个由248个氨基酸组成的多肽(蛋白序列号:ACI23563),分子量为28.09 kDa,等电点pI为8.99。GbMYB2蛋白包含2个MYB重复序列(25-72,78-123)。GbMYB2和R2R3-MYB类蛋白高度同源,表明该基因属于R2R3-MYB类型基因。Southern blot分析表明该基因在海岛棉中以低拷叭形式存在。RT-PCR分析表明GbMYB2基因在胚珠和其它组织中均有表达。Real-time PCR结果显示从-3 DPA到+12 DPA时期,GbMYB2基因表达量(ΔCT值)呈现由低到高的规律性变化,GbMYB2存徐州-142(wt)肝珠中的表达量高于在徐州-142无絮突变体(fl)中的表达量。RNA in situ hybridization结果显示GbMYB2基因存胚珠外表皮和纤维部位高水平转录。GbMYB2基因在转基因拟南芥中的过量表达使其表型发生了改变,如叶片变得宽大与褶皱、叶表皮毛有所增多、根系加长、开花期有所延迟等。
GbMYB3基因cDNA全长为1129 bp,包括1个长度为795 bp的ORF,1个长度为73 bp的5’端非翻译区和1个长度为271 bp的3’非翻译区,编码1个由264个氨基酸组成的多肽(蛋白序列号:ACI23564),分子量为29.63 kDa,等电点 pI为9.12。GbMYB3基因蛋白包含2个MYB苹复序列(14-61,67-112)。GbMYB3和R2R3-MYB类蛋白高度同源,表明该基因属于R2R3-MYB类型基因。Southern blot分析表明该基因在海岛棉中以低拷贝形式存在。RT-PCR分析表明GbMYB3基因在胚珠和其它组织中均有表达。Real-time PCR结果显示从-3 DPA到+12 DPA时期,GbMYB3基因表达量(ΔCT值)呈现由低到高的规律性变化,GbMYB3基因在徐州-142(wt)胚珠中的表达量要略微高于在徐州-142无絮突变体(fl)中的表达量。RNAin situ hybridization结果显示GbMYB3基因在胚珠的外表皮和纤维部位高水平转录。GbMYB3基因在转基因拟南芥中的过量表达使其表型发生了改变,如叶片变得皱缩、根系变角果长度变短等。