论文部分内容阅读
目的:设计和构建针对HER3基因mRNA的特异性RNA干扰质粒载体并转染人乳腺癌MDA-MB-453细胞株,研究此细胞株中HER3的RNA干扰抑制效率,以及HER3表达下调对细胞株生长增殖的影响,初步探讨RNA干扰技术防治乳腺癌的可行性。方法:设计两个shRNA序列,构建了两组针对HER3基因mRNA的可以稳定遗传的特异性RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-TetP-HER3的重组质粒(简称:RNAi-HER3质粒)。转染人乳腺癌MDA-MB-453细胞株,进行体外研究。用RT-PCR、Western Blotting和流式细胞术分别在mRNA水平和蛋白质水平检测重组质粒对乳腺癌MDA-MB-453细胞株HER3基因表达的抑制作用,MTT法检测细胞存活率,并观察转染重组质粒对细胞生长的影响。结果:(1). DNA测序结果显示,构建的2个重组质粒(依据设计shRNA序列的位点命名为RNAi-HER3-131、RNAi-HER3-326)符合试验设计要求。(2). RT-PCR技术检测,RNAi-HER3-131转染24小时后HER3mRNA表达量明显低于对照组,有明显的干扰作用;而RNAi-HER3-326转染24小时后HER3mRNA表达量与对照组相比无明显变化,提示RNAi-HER3-326干扰作用不明显。(3). Western Blotting技术及流式细胞术检测,RNAi-HER3-131转染MDA-MB-453细胞24小时后HER3的蛋白表达明显受抑;RNAi-HER3-326转染细胞与对照组相比蛋白表达无明显变化。(4). MTT法检测细胞的存活率,RNAi-HER3-131转染24小时后存活率显著低于对照组和RNAi-HER3-326转染组(P<0.01),而空载体转染组和RNAi-HER3-326转染组与对照组比,存活率无明显统计学差异(P>0.05)。结论:转染及RNA干扰技术建立的HER3表达抑制细胞可以成为简单实用的细胞模型;HER3-siRNA抑制HER3的表达后可在体外抑制MDA-MB-453细胞的存活。