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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是顶复门的一种专性胞内寄生原虫，它独特的双宿主生活周期使其能够广泛感染哺乳动物及部分冷血动物，因此弓形虫在人群中有着极高的感染率。在孕妇和免疫低下的人群中，弓形虫感染往往会造成较为严重的后果。巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种多功能多效应的细胞因子，具有广谱的生物活性，并能参与多种细胞信号通路，在肿瘤免疫及感染免疫等多个过程中发挥复杂的作用。据报道，弓形虫来源的巨噬细胞迁移抑制因子同系物(TgMIF)与哺乳动物来源的MIF具有一定的同源性，且越来越多的研究表明源于寄生虫的MIF是一种重要的致病因子，在宿主与寄生虫的相互作用中发挥重要的作用。本文通过CRISPR/Cas9技术构建并鉴定了弓形虫RHΔmif基因缺陷虫株，证实了TgMIF是影响弓形虫毒力的重要因子，为进一步明确弓形虫的致病机制奠定基础。
目的:
构建并鉴定弓形虫RHΔmif基因缺陷虫株并比较RHΔmif与野生（WT）型RH虫株之间的毒力差异。
方法:
将重组的pET-28a-TgMIF质粒转化大肠杆菌Rosetta中诱导表达，通过考马斯亮蓝染色的方法来鉴定纯化后的目的蛋白。然后将纯化后的蛋白与弗氏佐剂等体积混合并乳化，以皮下注射的方式免疫新西兰白兔，一段时间后收集血清并纯化，制备弓形虫特异性的兔多克隆MIF蛋白抗体。通过CRISPR/Cas9技术，运用E-CRISPR数据库设计特异性sgRNA，并使用Q5定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒，构建pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒，运用多片段连接试剂盒构建Donor质粒。然后将pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒以及由Donor质粒扩增的3个片段DNA通过电穿孔转染弓形虫，电转后的弓形虫接种于HFF细胞中，乙胺嘧啶药筛并挑取单克隆虫株。PCR和WB鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔmif株在HFF细胞里的增殖力与侵袭力。分别用200个RH株和RHΔmif株的速殖子腹腔感染BALB/c小鼠后统计小鼠的生存率。
结果:
1.诱导表达并纯化rTgMIF蛋白:
将pET-28a-TgMIF质粒转化入大肠杆菌Rosseta中诱导表达并纯化，取诱导前的菌液、诱导后且超声过后的上清液、纯化过后的蛋白进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，胶体经过考马斯亮蓝染色后证明重组的TgMIF蛋白已被成功的诱导表达。
2.制备rTgMIF特异性的兔多克隆抗体:
(1)制备多克隆抗体，将rTgMIF与佐剂等体积混合，在初次免疫之后进行3次加强免疫，最后一次免疫后2周取血，纯化多克隆抗体。
(2)ELISA检测多克隆抗体效价，用rTgMIF包被空板，取阴性血清2.1倍的阳性血清为抗体效价，结果显示抗体效价≥105。
(3)WB实验证明我们所制备的兔多克隆抗体具有良好的特异性，纯化后的抗体可在13KD处特异性识别rTgMIF蛋白，并且未检测出rTg14-3-3蛋白。
3.构建并鉴定弓形虫RHΔmif基因缺陷虫株:
(1)CRISPR/Cas9技术构建弓形虫敲除虫株，设计特异性的sgRNA引物，使用Q5定点突变试剂盒得到，pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒，将目的基因替换为dhfr。
(2)琼脂糖凝胶电泳结果显示成功扩增了弓形虫MIF基因组的同源臂上游(1000bp)、下游(1100bp)及DHFR基因(3000bp)。
(3)以构建的Donor质粒为模板，PCR扩增连接的三片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示约5000bp处出现特异性条带。
(4)WB实验证明筛选后的RHΔmif株不能产生TgMIF蛋白，而WT型RH株在13KD处检测到特异性条带。
(5)提取两种虫株的全基因组DNA并扩增PCR1、PCR2，结果显示仅RHΔmif虫株在1300bp及1400bp处出现特异性条带。
4.吉姆萨染色实验证明RHΔmif株有更强的侵袭及增殖能力：
将WT型RH株与RHΔmif虫株分别与HFF细胞共培养，在不同时间点取细胞进行吉姆萨染色，结果证明在被感染的细胞里RHΔmif株速殖子数量及增殖速度均高于WT型RH株。
5.小鼠生存率实验：
BABL/c小鼠腹腔感染相同数量的WT型RH株和RHΔmif株速殖子模拟急性感染模型，结果显示RHΔmif株感染组小鼠存活时间更短。
结论:
研究结果证明，TgMIF是影响弓形虫毒力的重要因子，与WT型RH株相比，RHΔmif株表现出更强的侵袭及增殖能力，为弓形虫的致病机制的研究奠定了基础。
目的:
构建并鉴定弓形虫RHΔmif基因缺陷虫株并比较RHΔmif与野生（WT）型RH虫株之间的毒力差异。
方法:
将重组的pET-28a-TgMIF质粒转化大肠杆菌Rosetta中诱导表达，通过考马斯亮蓝染色的方法来鉴定纯化后的目的蛋白。然后将纯化后的蛋白与弗氏佐剂等体积混合并乳化，以皮下注射的方式免疫新西兰白兔，一段时间后收集血清并纯化，制备弓形虫特异性的兔多克隆MIF蛋白抗体。通过CRISPR/Cas9技术，运用E-CRISPR数据库设计特异性sgRNA，并使用Q5定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒，构建pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒，运用多片段连接试剂盒构建Donor质粒。然后将pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒以及由Donor质粒扩增的3个片段DNA通过电穿孔转染弓形虫，电转后的弓形虫接种于HFF细胞中，乙胺嘧啶药筛并挑取单克隆虫株。PCR和WB鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔmif株在HFF细胞里的增殖力与侵袭力。分别用200个RH株和RHΔmif株的速殖子腹腔感染BALB/c小鼠后统计小鼠的生存率。
结果:
1.诱导表达并纯化rTgMIF蛋白:
将pET-28a-TgMIF质粒转化入大肠杆菌Rosseta中诱导表达并纯化，取诱导前的菌液、诱导后且超声过后的上清液、纯化过后的蛋白进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，胶体经过考马斯亮蓝染色后证明重组的TgMIF蛋白已被成功的诱导表达。
2.制备rTgMIF特异性的兔多克隆抗体:
(1)制备多克隆抗体，将rTgMIF与佐剂等体积混合，在初次免疫之后进行3次加强免疫，最后一次免疫后2周取血，纯化多克隆抗体。
(2)ELISA检测多克隆抗体效价，用rTgMIF包被空板，取阴性血清2.1倍的阳性血清为抗体效价，结果显示抗体效价≥105。
(3)WB实验证明我们所制备的兔多克隆抗体具有良好的特异性，纯化后的抗体可在13KD处特异性识别rTgMIF蛋白，并且未检测出rTg14-3-3蛋白。
3.构建并鉴定弓形虫RHΔmif基因缺陷虫株:
(1)CRISPR/Cas9技术构建弓形虫敲除虫株，设计特异性的sgRNA引物，使用Q5定点突变试剂盒得到，pSAG1::Cas9-U6::sgMIF质粒，将目的基因替换为dhfr。
(2)琼脂糖凝胶电泳结果显示成功扩增了弓形虫MIF基因组的同源臂上游(1000bp)、下游(1100bp)及DHFR基因(3000bp)。
(3)以构建的Donor质粒为模板，PCR扩增连接的三片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示约5000bp处出现特异性条带。
(4)WB实验证明筛选后的RHΔmif株不能产生TgMIF蛋白，而WT型RH株在13KD处检测到特异性条带。
(5)提取两种虫株的全基因组DNA并扩增PCR1、PCR2，结果显示仅RHΔmif虫株在1300bp及1400bp处出现特异性条带。
4.吉姆萨染色实验证明RHΔmif株有更强的侵袭及增殖能力：
将WT型RH株与RHΔmif虫株分别与HFF细胞共培养，在不同时间点取细胞进行吉姆萨染色，结果证明在被感染的细胞里RHΔmif株速殖子数量及增殖速度均高于WT型RH株。
5.小鼠生存率实验：
BABL/c小鼠腹腔感染相同数量的WT型RH株和RHΔmif株速殖子模拟急性感染模型，结果显示RHΔmif株感染组小鼠存活时间更短。
结论:
研究结果证明，TgMIF是影响弓形虫毒力的重要因子，与WT型RH株相比，RHΔmif株表现出更强的侵袭及增殖能力，为弓形虫的致病机制的研究奠定了基础。