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研究背景和目的
大量研究发现表观遗传变化在乳腺癌的发生和发展中发挥着重要作用，对抑癌基因启动子区的甲基化沉默是其主要途径。抑癌基因RPRM 虽然在多种恶性肿瘤中存在表观遗传调控，但是在乳腺癌中的研究仍不明确。本论文旨在研究 RPRM在乳腺癌中启动子甲基化的改变，分析其与临床病理资料的相关性，并进一步对其在乳腺癌细胞中的生物学功能进行探讨，以期探索乳腺癌的发生发展机制，为临床治疗提供实验依据及理论基础。
研究方法
1. RPRM在乳腺癌组织及乳腺癌细胞株中的表达情况。提取32例人乳腺癌和癌旁组织样本的RNA，荧光定量PCR检测RPRM基因的mRNA表达水平；生物信息学分析TCGA数据库中乳腺癌中RPRM的mRNA表达水平；荧光定量PCR检测3种雌激素受体（ER）阴性乳腺癌细胞株（BT549、MDA-MB231和MDA-MB468）和4种ER阳性乳腺癌细胞株（MCF-7、SK-BR-3、T47D和ZR-75-1）中RPRM的mRNA表达水平。
2. RPRM 启动子甲基化状态与乳腺癌的关系。通过甲基化特异性PCR（MSP）检测32例乳腺癌组织样本中RPRM的启动子甲基化水平，将甲基化状态与临床资料统计分析其相关性；通过MSP检测8例乳腺癌细胞株的RPRM启动子甲基化水平，并用5-氮杂-2-脱氧胞苷（AZA）和曲古抑菌素 A（TSA）处理后验证其甲基化与表达量的关系；分析TCGA数据库中乳腺癌资料的RPRM启动子甲基化与其表达量、乳腺癌类型、敏感性、生存率等之间的关系。
3. RPRM在乳腺癌中的生物学功能及其机制。以RPRM真核表达质粒转染乳腺癌细胞株BT549和MDA-MB231，RT-PCR和Western blot验证其mRNA和蛋白质表达水平；免疫荧光法检测RPRM在细胞中的定位；CCK-8 实验测定细胞活力；克隆形成实验检测其增殖；流式细胞术检测细胞周期和凋亡；划痕愈合实验和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1，以及细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase8和cleaved PARP。
研究结果
1.在32例乳腺癌中，RPRM在27例（84.4%）的mRNA表达水平低于其相应的癌旁组织（p＜0.05）；RPRM在TCGA数据库中的乳腺癌数据结果显示，各型乳腺癌（包括粘液癌4例、男性乳腺癌3例、浸润性导管癌（IDC）389例、浸润性小叶癌（ILC）36例、IDC和ILC混合型10例），相对于正常乳腺组织（61例）都存在RPRM的表达降低，且有统计学差异（p＜0.01）；RPRM在雌激素受体（ER）阴性的乳腺癌细胞株（BT549、MDA-MB231和MDA-MB468）中的表达水平显著低于在ER阳性的乳腺癌细胞株（MCF-7、SK-BR-3、T47D和ZR-75-1）中的表达水平，甚至缺失。
2. RPRM基因启动子在32例乳腺癌组织中的甲基化率为71.9%， Fisher’精确检验分析了 RPRM 启动子甲基化同乳腺癌临床病理数据之间的关系，结果无统计学意义。
RPRM 基因启动子在 4 株乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB231、MDA-MB468和HBL100）中发生了甲基化。两株乳腺癌细胞（BT549和MDA-MB231）经AZA和TSA处理后恢复了RPRM的表达或者表达增强，其甲基化状态减弱或者消失。
对TCGA数据库中的GSE66313分析结果显示，RPRM在乳腺导管内原位癌（DCIS）和乳腺浸润性导管癌（IDC）中的启动子甲基化水平显著高于正常乳腺组织（p＜0.01和p＜0.001）；Spearman相关分析发现，RPRM甲基化与其mRNA表达量之间存在着明显的负相关性；IDC和正常乳腺组织的RPRM甲基化的受试者工作特征曲线（ROC）分析发现ROC曲线下面积为0.8033，说明以RPRM甲基化来诊断乳腺癌具有一定的准确性；Kaplan-Meier生存曲线显示，RPRM启动子甲基化在雌激素受体（ER）阴性乳腺癌预后中具有重要价值，而与 ER 阳性乳腺癌的预后无关。
3. 免疫荧光实验发现过表达的 RPRM 蛋白质定位在细胞浆中；CCK-8和克隆形成实验结果提示，过表达RPRM的乳腺癌细胞BT549和MDA-MB231与对照组相比，生长受到显著抑制（p＜0.05）；流式细胞术发现过表达 RPRM 后乳腺癌细胞凋亡增加，细胞周期阻滞于 G1期（p＜0.05和p＜0.001）；划痕愈合实验和Transwell实验提示，过表达RPRM 后乳腺癌细胞迁移和侵袭能力受到显著抑制（p＜0.05 和p＜0.001）。Western blot结果显示过表达RPRM后乳腺癌细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1和凋亡相关蛋白cleaved Caspase8和cleaved PARP表达均增加（p＜0.05）。
结论
1. 乳腺癌RPRM基因受表观遗传调控，启动子区高甲基化状态导致基因表达沉默和降低。
2. 乳腺癌RPRM基因启动子甲基化水平与患者预后有相关性。
3. 在乳腺癌细胞BT549和MDA-MB231的细胞中，RPRM可能通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1，上调cleaved-Caspase8和cleaved-PARP的表达，促进癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移和侵袭，使细胞周期阻滞在G1期，发挥了抑癌基因的功能。
大量研究发现表观遗传变化在乳腺癌的发生和发展中发挥着重要作用，对抑癌基因启动子区的甲基化沉默是其主要途径。抑癌基因RPRM 虽然在多种恶性肿瘤中存在表观遗传调控，但是在乳腺癌中的研究仍不明确。本论文旨在研究 RPRM在乳腺癌中启动子甲基化的改变，分析其与临床病理资料的相关性，并进一步对其在乳腺癌细胞中的生物学功能进行探讨，以期探索乳腺癌的发生发展机制，为临床治疗提供实验依据及理论基础。
研究方法
1. RPRM在乳腺癌组织及乳腺癌细胞株中的表达情况。提取32例人乳腺癌和癌旁组织样本的RNA，荧光定量PCR检测RPRM基因的mRNA表达水平；生物信息学分析TCGA数据库中乳腺癌中RPRM的mRNA表达水平；荧光定量PCR检测3种雌激素受体（ER）阴性乳腺癌细胞株（BT549、MDA-MB231和MDA-MB468）和4种ER阳性乳腺癌细胞株（MCF-7、SK-BR-3、T47D和ZR-75-1）中RPRM的mRNA表达水平。
2. RPRM 启动子甲基化状态与乳腺癌的关系。通过甲基化特异性PCR（MSP）检测32例乳腺癌组织样本中RPRM的启动子甲基化水平，将甲基化状态与临床资料统计分析其相关性；通过MSP检测8例乳腺癌细胞株的RPRM启动子甲基化水平，并用5-氮杂-2-脱氧胞苷（AZA）和曲古抑菌素 A（TSA）处理后验证其甲基化与表达量的关系；分析TCGA数据库中乳腺癌资料的RPRM启动子甲基化与其表达量、乳腺癌类型、敏感性、生存率等之间的关系。
3. RPRM在乳腺癌中的生物学功能及其机制。以RPRM真核表达质粒转染乳腺癌细胞株BT549和MDA-MB231，RT-PCR和Western blot验证其mRNA和蛋白质表达水平；免疫荧光法检测RPRM在细胞中的定位；CCK-8 实验测定细胞活力；克隆形成实验检测其增殖；流式细胞术检测细胞周期和凋亡；划痕愈合实验和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1，以及细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase8和cleaved PARP。
研究结果
1.在32例乳腺癌中，RPRM在27例（84.4%）的mRNA表达水平低于其相应的癌旁组织（p＜0.05）；RPRM在TCGA数据库中的乳腺癌数据结果显示，各型乳腺癌（包括粘液癌4例、男性乳腺癌3例、浸润性导管癌（IDC）389例、浸润性小叶癌（ILC）36例、IDC和ILC混合型10例），相对于正常乳腺组织（61例）都存在RPRM的表达降低，且有统计学差异（p＜0.01）；RPRM在雌激素受体（ER）阴性的乳腺癌细胞株（BT549、MDA-MB231和MDA-MB468）中的表达水平显著低于在ER阳性的乳腺癌细胞株（MCF-7、SK-BR-3、T47D和ZR-75-1）中的表达水平，甚至缺失。
2. RPRM基因启动子在32例乳腺癌组织中的甲基化率为71.9%， Fisher’精确检验分析了 RPRM 启动子甲基化同乳腺癌临床病理数据之间的关系，结果无统计学意义。
RPRM 基因启动子在 4 株乳腺癌细胞（BT549、MDA-MB231、MDA-MB468和HBL100）中发生了甲基化。两株乳腺癌细胞（BT549和MDA-MB231）经AZA和TSA处理后恢复了RPRM的表达或者表达增强，其甲基化状态减弱或者消失。
对TCGA数据库中的GSE66313分析结果显示，RPRM在乳腺导管内原位癌（DCIS）和乳腺浸润性导管癌（IDC）中的启动子甲基化水平显著高于正常乳腺组织（p＜0.01和p＜0.001）；Spearman相关分析发现，RPRM甲基化与其mRNA表达量之间存在着明显的负相关性；IDC和正常乳腺组织的RPRM甲基化的受试者工作特征曲线（ROC）分析发现ROC曲线下面积为0.8033，说明以RPRM甲基化来诊断乳腺癌具有一定的准确性；Kaplan-Meier生存曲线显示，RPRM启动子甲基化在雌激素受体（ER）阴性乳腺癌预后中具有重要价值，而与 ER 阳性乳腺癌的预后无关。
3. 免疫荧光实验发现过表达的 RPRM 蛋白质定位在细胞浆中；CCK-8和克隆形成实验结果提示，过表达RPRM的乳腺癌细胞BT549和MDA-MB231与对照组相比，生长受到显著抑制（p＜0.05）；流式细胞术发现过表达 RPRM 后乳腺癌细胞凋亡增加，细胞周期阻滞于 G1期（p＜0.05和p＜0.001）；划痕愈合实验和Transwell实验提示，过表达RPRM 后乳腺癌细胞迁移和侵袭能力受到显著抑制（p＜0.05 和p＜0.001）。Western blot结果显示过表达RPRM后乳腺癌细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1和凋亡相关蛋白cleaved Caspase8和cleaved PARP表达均增加（p＜0.05）。
结论
1. 乳腺癌RPRM基因受表观遗传调控，启动子区高甲基化状态导致基因表达沉默和降低。
2. 乳腺癌RPRM基因启动子甲基化水平与患者预后有相关性。
3. 在乳腺癌细胞BT549和MDA-MB231的细胞中，RPRM可能通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1，上调cleaved-Caspase8和cleaved-PARP的表达，促进癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移和侵袭，使细胞周期阻滞在G1期，发挥了抑癌基因的功能。