论文部分内容阅读
目的:我们的前期研究表明在小鼠实验性干燥综合征（experimental Sj（?）gren syndrome,ESS）疾病进程中,小鼠体内逐渐升高的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand,GITRL）能下调髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）的免疫抑制功能,进而促进疾病进程。然而,GITRL调控MDSCs免疫抑制功能的分子机制尚不明确。本研究主要探究GITRL刺激MDSCs后其胞内信号的传导过程,揭示GITRL调控MDSCs免疫抑制功能的分子机制。方法:（1）构建ESS小鼠模型,通过免疫磁珠法分选疾病早期（初次免疫后第18天）小鼠脾脏中的MDSCs,GITRL蛋白刺激MDSCs后与CD4+T细胞共培养,流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测CFSE标记的CD4+T细胞的增殖率以反映MDSCs的免疫抑制能力;比色法检测MDSCs免疫抑制效应分子精氨酸酶1（arginase-1,Arg-1）的活性,Griess偶联法检测一氧化氮（nitric oxide,NO）的释放量。（2）分选早期ESS小鼠脾脏MDSCs,GITRL蛋白刺激MDSCs后,采用Western blot检测MDSCs胞内与其功能相关的信号分子的活化情况,包括两面神激酶（Janus Kinase,JAK）、信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription,STAT）、蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）（又称AKT）,采用磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）活性检测试剂盒检测PI3K的活性。进一步采用AKT特异性活性抑制剂MK-2206阻断AKT路径后,检测STAT3的磷酸化水平,以检测AKT是否是STAT3的上游调控分子。接着,我们通过Western blot检测了可能调控AKT活性的上游分子第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）的活性。进一步地,采用PTEN特异性活性抑制剂VO-OHpic抑制MDSCs中PTEN活性后,再用GITRL蛋白处理MDSCs,Western blot检测MDSCs胞内AKT、STAT3的磷酸化水平,以确认GITRL是否通过PTEN调控AKT和STAT3的活性;同时,在该体系下检测MDSCs的免疫抑制功能,包括其对CFSE标记的CD4+T细胞增殖的抑制能力、免疫抑制效应分子Arg-1的活性以及NO的释放量,以探究GITRL是否通过调控PTEN活性影响MDSCs的免疫抑制功能。（3）由于GITR信号激活后,可招募下游接头蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor associated factor,TRAF）,进一步活化下游信号分子。首先,我们通过免疫共沉淀法检测GITR能否与TRAF3结合。接着,我们利用si RNA敲减MDSCs胞内TRAF3的表达,经GITRL蛋白处理后,Western blot检测PTEN的活性,以确认招募的TRAF3分子对下游PTEN活性的调控作用。由于蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）可特异性去磷酸化PTEN,增强PTEN的活性,因此我们通过免疫共沉淀法检测TRAF3是否能与PP2A结合,并使用PP2A的特异性活性抑制剂冈田酸（okadaic acid,OA）抑制PP2A的活性,Western blot检测PTEN的磷酸化水平,以确认TRAF3是否通过结合PP2A去磷酸化PTEN,从而调控PTEN的活性。（4）为了体内验证GITRL是否通过调控PTEN活性影响MDSCs免疫抑制功能,我们分选了早期ESS小鼠脾脏MDSCs,采用PTEN特异性活性抑制剂VO-OHpic阻断MDSCs中PTEN活性,再经GITRL蛋白处理后,分别于初次免疫后的第18天和第25天经尾静脉过继转移至ESS小鼠体内,检测ESS小鼠疾病相关指标。监测ESS小鼠疾病进程中的唾液流速,通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中抗唾液腺（salivary gland,SG）蛋白抗体、抗干燥综合征抗原A（Sj（?）gren syndrome-related antigen A,Ro/SSA）抗体、抗核抗体（anti-nuclear antibody,ANA）和抗毒蕈碱胆碱能受体3（muscarinic cholinergic receptor 3,M3R）抗体的水平,并采用FCM检测脾脏和颈部引流淋巴结中Th1和Th17细胞的比例和数量。结果:（1）经GITRL蛋白处理后,MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用减弱（p<0.001）,且MDSCs效应分子Arg-1的活性显著降低（p<0.01）,NO的释放量显著减少（p<0.001）,说明GITRL蛋白能够下调MDSCs的免疫抑制功能。（2）GITRL蛋白刺激MDSCs后,其胞内AKT、STAT3信号分子的磷酸化水平显著降低（p<0.01）,而其他信号分子JAK1、JAK2、STAT1的磷酸化水平并无明显变化,且AKT上游调控分子PI3K的活性也无明显变化。然而,当抑制MDSCs中AKT活性后,其胞内STAT3的磷酸化水平显著升高（p<0.001）,表明GITRL刺激后,MDSCs胞内AKT能够影响STAT3的活性,为STAT3的上游调控分子。进一步研究发现,GITRL蛋白处理MDSCs后,AKT上游负向调控分子PTEN磷酸化水平显著降低（p<0.01）,活性增强。当抑制MDSCs中PTEN活性后,其胞内AKT（p<0.001）、STAT3（p<0.01）的磷酸化水平明显升高,说明GITRL可通过调控PTEN活性影响AKT、STAT3的活化。此外,抑制MDSCs胞内PTEN活性后,MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用增强,相关效应分子Arg-1的活性升高（p<0.05）,NO的释放量增加（p<0.01）,表明GITRL可通过活化PTEN下调MDSCs的免疫抑制功能。以上研究结果表明GITRL可通过PTEN/AKT/STAT3信号通路下调MDSCs的免疫抑制功能。（3）经GITRL蛋白处理后,MDSCs胞内GITR能与接头蛋白TRAF3结合,而当TRAF3被敲减后,PTEN活性降低,说明GITR可招募TRAF3调控PTEN的活性。进一步研究发现,TRAF3可与蛋白磷酸酶PP2A结合,且抑制PP2A活性后,PTEN活性下降。以上结果说明GITRL刺激MDSCs表面GITR后,GITR通过招募TRAF3,进而结合PP2A调控PTEN的活性。（4）阻断MDSCs胞内PTEN活性后,再经GITRL蛋白处理,将其过继转移至ESS小鼠体内。与对照组小鼠相比,PTEN抑制组的小鼠唾液流速明显升高（p<0.05）,血清中抗SG蛋白抗体（p<0.05）、抗Ro/SSA抗体（p<0.01）、ANA（p<0.05）和抗M3R抗体（p<0.01）水平明显降低,小鼠脾脏和颈部引流淋巴结中Th1和Th17细胞比例与数量均明显降低（p<0.01）。以上结果进一步体内验证了GITRL通过调控PTEN活性影响MDSCs免疫抑制功能。结论:体外实验结果表明,GITRL激活MDSCs表面GITR后,GITR可招募接头蛋白TRAF3,TRAF3进一步招募蛋白磷酸酶PP2A,使PTEN去磷酸化,增强PTEN的活性,进而抑制下游AKT/STAT3信号通路,从而抑制MDSCs的免疫抑制功能;进一步地,利用ESS小鼠模型,体内验证了GITRL通过调控PTEN活性影响MDSCs免疫抑制功能。