研究背景骨内种植体的研究中,增强成骨能力和缩短愈合时间一直是人们必须考虑的方向。然而类似于糖尿病、骨质疏松、血液病在内的一些全身性疾病都会对钛植入物的生物性能产生不利影响,比如骨传导能力。并且,钛种植体的表面粗糙度、形态、电化学性质和所带电荷等因素对种植体的生物相容性和骨整合性都有着重要影响,因此各种技术和研究都专注于改善这些因素。在钛的表面修饰中,二氧化钛纳米管列(Titanium dioxide nanotubes,TNTs)是钛(Ti)阳极氧化制备的纳米管结构,其特征是有着高度自序的氧化物纳米结构以及多样的形态,如中空、圆柱、六角形等形状,并具备了许多独特性,表现出加速成骨细胞的粘附或增殖能力,诱导细胞因子释放的能力,以及影响生物活性,使药物搭载释放等能力。此外,纳米管结构还是一种优良的生物材料,具有较高的表面面积体积比和可控的尺寸范围,提高了生物相容性,这样来就可以使用不同尺寸的纳米管以增强成骨细胞的功能。TNTs修饰过的植入物作为一种新的植入物开始在成骨反应,肿瘤治疗,载药等领域开始了广泛的探究。重要的是,TNTs还可以作为治疗药物和抗菌药物的载体,尤其是在药物搭载上面,其“试管”样的结构给予了药物安装位点。许多研究着力于植入物搭载抗生素、成骨蛋白、抗癌药物或者抗炎药物的研究。虽然纳米管阵列已经证明对骨细胞和材料的相互作用有效应,但是纳米管阵列结构在药物、化合物和生物分子从植入物到骨的传递等方面的生物学性能还需要研究,以便在临床应用和口腔植入物中使用。目的通过在大鼠颌骨内植入不同实验组别的植体,分析在TNTs表面植体搭载抗菌药物后,对骨组织及炎症状态下骨形成的情况。评价在诱导细菌性炎症的条下,TNTs表面植体搭载药物后对骨结合的影响。研究搭载了 Pac-525的TNTs表面植体在大鼠颌骨内对种植体周围炎影响的相关机制。材料与方法1、Ti、Pac525-Ti、TNTs-Ti 和 TNTs-Pac525-Ti 的准备。商业纯钛采用阳极氧化法将商业纯钛置于电解液中,采用16V电压,氧化反应4h,制备表面纳米管结构。扫描电镜下,观察纳米管表面形态,分析纳米管直径,形状,长度。2、表面接触角测量评价材料疏水性及亲水性。在离表面5cm处滴入0.1ml蒸馏水,测量表面润湿性。水滴的形状是用立体显微镜测量接触角,评价亲水行为。3、药释曲线绘制使用分光光度计测量从P-Ti组及TNTs-P-Ti组植体释放的Pac-525的量。从加载药物之日起,将每个样本在室温下浸入1ml高温灭菌处理后的生理盐水中,每隔一天将样品溶液转移至24孔板中,通过290nm的紫外线检测测量药物释放量。重复操作1周,用已知的Pac-525浓度吸光曲线确定未知浓度。(纯钛组:Ti组;Pac-525搭载纯Ti组:P-Ti组;纳米管Ti组:TNTs-Ti组;Pac-525搭载纳米管Ti组:TNTs-P-Ti组)4、TNTs表面植体搭载Pac-525在大鼠体内研究。拔除八周龄约250g雄性SD大鼠左侧下颌第一臼齿。待拔牙窝新骨形成后,以900r/min用钻孔机钻出一个孔,并用盐水冲洗配合植入5×0.8mm植体,共振频率分析机械稳定性>75认为植入成功。并利用丝线栓结引入龈下菌斑,诱导周围环境细菌性炎症。利用micro-CT分析成骨过程及骨愈合情况。5、大鼠颌骨标本研究实验性种植体周围炎相关分子机制。植入种植体四周后麻醉下空气栓塞法处死实验动物。取出植体,植体周围骨组织脱水研磨。溶解提组织蛋白后利用Western Blot法,研究RANKL、BMP-2、BMP-7蛋白表达差异。利用qRT-PCR分析TNF-α、IL-1β基因表达差异。结果1、制备钛表面 TiO2纳米管结构,FE-SEM(Field emission scanning electron microscopy)下观察,孔径约50nm±15nm,长约1.26μm的有序排列的密集纳米级管状结构,而未做处理的钛种植体表面显示出光滑的表面。2、蒸馏水在Ti组表面上的平均接触角为46.3°,表明表面具有疏水性,在TNTs-Ti组表面平均接触角为14.7°,在P-Ti组的平均接触角为12.1°,表明TNTs-Ti组和P-Ti组有相似的亲水性。而在TNTs-P-Ti组显示的平均接触角为8.7°,TNTs-P-Ti组表现出了更优的亲水性。3、在纯钛和纳米管Ti上执行Pac-525搭载将Ti表面浸入10 ml Pac-525溶液中。分光光度计测定7日内释放Pac-525的量。Pac-525参考在290 nm吸收峰值处的浓度。第1天,从TNTs-P-Ti组表面释放的Pac-525的度比P-Ti组表面多约0.3 mM。释放测试后两天,P-Ti显示出从表面释放的Pac-525量显着减少(<0.1mM),而TNTs-P-Ti组表面显示出直到第5天连续的更高的Pac-525释放量和持续释放能力。结果表明,Pac-525被成功地加载到TNTs-Ti表面并能够持续从纳米管释放到周围区域更长的时间。4、SD大鼠左侧下颌第一臼齿拔牙过程顺利,拍摄micro-CT显示拔牙窝内没有异物残留,周围骨完整,见清晰的牙槽间隔。5、4周后micro-CT观察的SD大鼠左侧下颌第一臼齿区骨愈合良好,愈合后骨组织密度与周围组织大致相同。6、植体植入SD大鼠左侧第一臼齿区,共振频率测量ISQ值均大于75,各组无统计学差异。1周后TNTs-P-Ti组大鼠ISQ值显著大于Ti组及P-Ti组,大于TNT-Ti组大鼠。7、4周后,micro-CT显示TNTs-P-Ti组植体周围骨量显著大于Ti组。BIC%值显示TNTs-P-Ti组植体周围骨量显著大于Ti组,大于P-Ti组及TNT-Ti组。8、植体周围组织Western Blot结果显示RANKL蛋白表达水平在TNTs-P-Ti组小于其他各组。BMP-2、BMP-7蛋白表达水平在TNTs-P-Ti组及TNT-Ti组大于Ti组及P-Ti组。9、qRT-PCR结果分析显示TNTs-P-Ti组及TNT-Ti组的TNF-α、IL-1β表达量低于Ti组及P-Ti组。TNTs-P-Ti组显示出的表达量更低。结论1、通过阳极氧化反应在稳定的反应体系中,制备的纳米管结构形态是密集且较为有序的。TNTs-P-Ti组和TNT-Ti组均具有表面亲水行为。TNTs-P-Ti组显示了更好的亲水性能。2、在纯Ti和纳米管Ti表面上可以加载Pac-525药物,并且均展示了连续向周围释放加载药物的可能。3、实验植体可以顺利植入大鼠下颌第一臼齿区域内,并且均可获得良好的稳定性。4、经Pac-525搭载的纳米管Ti组相比于其他实验组表现出种植体周围炎性骨破坏减轻的症状和成骨能力加强的表现。5、经Pac-525搭载的纳米管Ti具有减弱RANKL分子表达的能力,纳米管Ti结构有提高BMP-2、BMP-7蛋白表达量的能力,表现出一定地刺激骨形成的作用。6、纳米管结构自身有着一定地抑制炎症发展的作用,而持续的药物释放也更大程度上减轻的周围炎症的发生。