静脉全麻药丙泊酚因其起效快、持续时间短、苏醒迅速等优点,广泛用于临床麻醉的诱导、维持以及重症病人的镇静。除了麻醉作用外,研究发现,丙泊酚还具有抗氧化、神经保护、免疫调节、止吐等非麻醉作用。近年来,随着肿瘤发病率越来越高,探讨麻醉方式和麻醉药物包括丙泊酚对肿瘤转移的影响成了热点。研究表明,丙泊酚可以促进T淋巴细胞的分化,增强抗肿瘤免疫作用；还可以激活γ-氨基丁酸受体,抑制结肠癌细胞的转移；也可以抑制NF-κB的活性,减少乳腺癌细胞中基质金属蛋白酶的表达,抑制其侵袭转移能力；肺癌细胞中,丙泊酚同样可下调基质金属蛋白酶的表达,抑制细胞侵袭转移。由此可见,丙泊酚对大多数肿瘤细胞而言,表现为抑制作用。转移相关基因(Metastasis-associated gene, MTA)家族与肿瘤的发生和发展密切相关。它包含3个不同基因(MTA1、MTA2、MTA3)和6个已知亚型(MTA1、MTAls、MTAl-ZG29p、MTA2、MTA3、MTA3L)。其中,MTA1、MTA2和MTA3均被认为是细胞核小体重塑和组蛋白去乙酰化酶复合物的组成部分,它们通过影响染色质的状态调整DNA复制及调控组蛋白去乙酰化过程发挥生物学功能。MTA1是这个家族中第一个发现的成员,它位于人类染色体14q32.3,全长为2.2kb。包含一个独立阅读开放框,起始密码位于97-99位核苷酸,终止密码位于2206-2208位核苷酸。MTA1蛋白的羧基末端有2个SH结合域,这个区域不仅参与信号传导通路中蛋白与蛋白之间相互作用的调控,还构成细胞骨架成分。MTA1蛋白分子中还包含一些蛋白与蛋白、蛋白与DNA相互作用的结构域,如BAH结构域、SANT结构域、GATA锌指模体等,这些结构可能参与恶性肿瘤的侵袭转移。MTA1在乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肺癌、胃癌、大肠癌等肿瘤组织均过度表达,且与肿瘤的分期、分级、淋巴结转移及不良预后相关。研究发现,MTA1可通过多种途径影响肿瘤转移：①MTA1通过影响染色体复制,调控组蛋白去乙酰基过程,作用于某些抑癌基因,下调其转录,促进肿瘤转移；②MTA1可以将缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)募集到组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)上,使其乙酰化,增强HIF-1α的转录和其蛋白稳定性,促进血管生成,增加肿瘤细胞的转移潜能；③MTAl蛋白可使p53基因脱乙酰化,抑制p53基因诱导的细胞凋亡；④MTA1可以显著改变细胞角蛋白丝系统的组装及细胞骨架蛋白的定位,使细胞获得具有侵袭能力和转移能力的表型；⑤MTA1可作为Wntl转录和翻译的重要的上游调节因素,抑制Six3表达导致Wntl去阻遏,促进Wntl的转录和翻译,启动Wnt信号传导通路。而阻断或下调MTA1的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力,MTA1可作为肿瘤治疗的一个靶目标。Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络,至少包括三条信号通路：①经典信号通路：Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路,主要在细胞核内激活靶基因；②细胞极性通路：Wnt/PCP通路,主要涉及氨基末端激酶和细胞骨架重构；③Wnt/Ca2+信号通路,主要调节细胞运动和细胞粘着性。它们参与细胞分化、细胞极性形成、细胞迁移和增殖等生物学过程。而经典信号通路还参与肿瘤的发生发展过程。Wntl是Wnt经典信号通路中的主要成员之一,也是Wnt家族中发现的第一个成员。在Wnt信号通路中：当Wntl蛋白信号存在时,Wntl与靶细胞上相对应的跨膜受体卷曲蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)特异性结合,激活胞内散乱蛋白,抑制胞内游离p-连环蛋白的降解并使其在胞内逐渐积聚,进而转运到细胞核内,与淋巴细胞因子／淋巴增强因子等DNA结合蛋白形成复合物,激活下游相关靶基因c-Myc、cyclin D1、 Slug等的转录,抑制E-钙粘素等的表达,增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。而当Wntl蛋白信号缺失时,p-连环蛋白与APC和轴蛋白形成复合物,促使p-连环蛋白以泛素化方式降解。导致细胞核内无β-连环蛋白聚集。使得辅阻遏物与淋巴细胞因／淋巴增强因子等作用,抑制相关基因转录。在乳腺癌、胃癌、肝癌、大肠癌、前列腺癌等肿瘤组织中,Wntl均过度表达,且与肿瘤的分期、分级、淋巴结转移等相关。因此,Wntl是影响肿瘤侵袭转移的重要因素之一。MTAl可作为Wntl转录和翻译的重要的上游调节因素,而且MTA1和Wntl与肿瘤的发生发展密切相关,阻断或下调二者的表达,可以抑制肿瘤生长和转移。丙泊酚是否通过降低MTAl和Wntl在肿瘤组织中的表达发挥抗肿瘤效应,未见报道。本实验通过MADB106肿瘤细胞大鼠肺转移模型,观察不同剂量丙泊酚对肿瘤转移及转移瘤组织MTA1和Wntl表达的影响。材料和方法1.动物准备与分组40只清洁级Fischer344雄性大鼠,12-14周龄,体重200-220g,随机分为4组：生理盐水组(S组)、脂肪乳剂组(F组)、丙泊酚30mg/kg组(P30组)和50mg/kg组(P50组),每组10只。实验前后,大鼠均饲养在标准动物实验室(室温25-27℃,湿度50%-70%,5只一笼,自由摄取食物和水,早晚8：00做灯光变换,避免强光刺激)。2.实验细胞及培养传代MADB106肿瘤细胞系,来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心,是乳腺癌肺转移癌细胞经Fischer344大鼠卵化培养的高选择性细胞系,经静脉注射后高选择性的种植在大鼠肺部形成转移瘤。将MADB106中瘤细胞培养于含有90%RMPI1640培养液,10%胎牛血清和0.1%双抗的完全培养基中,放置在温度为37℃,含5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞常规培养于细胞培养皿中,每2-3天更换一次培养液,并用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代,传代比例约为1：2-1：3,一周大概传代1-2次,控制细胞传代次数在20代以内。3.实验实施过程腹腔注射1%戊巴比妥钠50mg/kg诱导,待大鼠达到预定麻醉深度(翻正反射和角膜反射消失)后,行股静脉置管。S组：以5ml/kg的剂量泵入生理盐水1h；F组：以5ml/kg的剂量泵入脂肪乳剂1h；P30组：以30mg/kg的剂量泵入丙泊酚1h；P50组：以50mg/kg的剂量泵入丙泊酚1h；麻醉过程中使用加热毯使实验大鼠肛温保持在36-37℃,间断计数呼吸频率和心率,呼吸频率保持在约60次/分,心率保持在320-340次/分左右。分别泵入上述药物30min后,用0.25%胰蛋白酶消化MADB106肿瘤细胞并在倒置显微镜下计数,用PBS溶液稀释到浓度为2×105ml。待各组泵入上述生理盐水或药物1h后,每只大鼠均经股静注0.5mlMADB106肿瘤细胞。拔除股静脉置管,缝合切口,肌注青霉素2万U/kg。实验完毕后,将大鼠继续在标准动物实验室饲养3周。4.标本采集3周后1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,颈部正中切开,行气管插管并固定。放血处死大鼠后,快速打开胸腔分离左右肺。将大鼠置于头高脚低位,经气管插管缓慢注入4%多聚甲醛固定液,待整个肺的下3/4完全膨胀后停止注入固定液,取出全肺,用生理盐水冲洗肺表面,将全肺投入4%多聚甲醛固定液中固定24小时。5.肺部转移瘤计数将固定好的肺组织取出,放在滤纸上吸干表面的固定液后,由两名未参与实验人员直接计数肺表面转移瘤数目,并进行统计。6.免疫组化染色标本经石蜡包埋,切成4μm薄片,贴于载玻片上,经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水,蒸馏水洗5min；热修复抗原后自然冷却,PBS洗3次,5min／次；在3%H202孵育5-10min消除内源性过氧化酶影响；PBS洗3次,5mmin/次；滴加正常山羊血清封闭液室温下20-30min,甩去多余液体；滴加一抗4℃过夜；37℃下复温30min; PBS洗3次,5min/次；加生物素化二抗,室温下30min; PBS洗3次,5min/次；DAB显色；蒸馏水冲洗,苏木素复染；脱水、透明、封片。7.免疫组化图片分析在400倍高倍镜下随机选取5个视野用Olympus DP70CCD采集图像。采用Image-pro plus10.0免疫组化彩色图像分析系统对结果进行半定量分析,以图片中一个阳性细胞为基础,测定、分析整幅图片的阳性细胞平均光密度(OD)值。8.统计方法采用SPSS13.0统计学软件,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson法,以P<0.05认为具有统计学意义。结果1.肺转移瘤数目S组和F组的肺转移瘤数目分别为13.50±2.63个和12.20±2.15个,差异无统计学意义(P>0.05)。与S组和F组相比,P30组和P50组的肺转移瘤数目分别为7.00±1.05个和4.20±1.55个,两组肺转移瘤数目减少,差异有统计学意义(P<0.01)。1930组和P50组中肺转移瘤数目与丙泊酚剂量负相关,Pearson相关系数为-0.879(P<0.01)。2.转移瘤MTAl和Wntl表达MTAl主要在转移瘤的细胞核内表达。S组和F组的OD值分别为1.33±0.14和1.27±0.83,表达无显著差异(P>0.05)。P30组和P50组的OD值分别为0.93±0.91和0.53±0.13,两组差异显著(P<0.01),且均明显低于S组和F组(P<0.01)。MTA1的表达与丙泊酚剂量负相关,Pearson系数为-0.980(P<0.01)。Wntl主要在转移瘤的细胞质内表达,S组和F组的OD值分别为0.67±0.90和0.63±0.73,差异无统计学意义(P>0.05)；P30组和P50组的OD值差异显著(P<0.01),分别为0.35±0.30和0.24±0.34,均明显低于S组和F组(P<0.01)。Wntl的表达与丙泊酚剂量负相关,Pearson系数为-0.916(P<0.01)。MTA1和Wnt1的表达正相关,Pearson系数为0.902(P<0.01)。结论丙泊酚呈剂量依赖性抑制荷瘤大鼠MADB106肿瘤细胞肺转移,并下调转移瘤中MTA1和Wnt1的表达。