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玉米（Zea mays L.）是重要的粮经饲作物,其发展与粮食安全密切相关。β-1,3-葡聚糖酶的功能几乎贯穿植物生长发育的各个时期,并与植物的抗病性及抗逆性生理相关,对玉米β-1,3-葡聚糖酶基因的研究将会为玉米籽粒发育及产量和抗性育种提供一定的参考价值。本实验运用同源克隆的方法得到了2个玉米自交系中包括完整开放阅读框（ORF）的cDNA及其对应的基因组序列,并进行功能预测、实时定量表达分析、原核诱导表达以及Western Blot分析;研究还构建了超表达载体并转化拟南芥进行初步功能分析。研究结果为下一步进行ZmEGP蛋白的纯化及酶活性的检测,研究ZmEGP在玉米籽粒发育及其它代谢过程中的生物功能奠定了较好基础。主要研究结果如下:1.课题组利用大粒马齿型玉米自交系丹232和小粒爆裂型自交系N04不同发育时期果皮和胚乳构建了差异蛋白库,从中选择预测为内切β-1,3-葡聚糖酶的肽段,在NCBI中同源搜索基因的RNA序列进行同源克隆,得到的cDNA序列全长1635 bp,编码区1389 bp,5’UTR为14 bp,3’UTR为232 bp,命名为ZmEGP。比较2个自交系ZmEGP的cDNA及相应DNA序列发现,除编码区SNPs外,其主要差异在于第一个intron区域的31个SNPs及4处InDels。利用生物信息学软件对其编码蛋白进行预测得知,ZmEGP蛋白包含GH17和X8结构域,属于糖基水解酶第17家族成员,同时对ZmEGP蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级和三级结构等进行了预测。2.用DNAMAN进行ZmEGP及其同源序列的系统进化分析发现,ZmEGP与双子叶植物来源的序列同源性较低,仅为49%,而与单子叶禾本科植物来源的序列同源性稍高,其中同源性最高的序列来源于高粱,为90%,其次是粟,为86%;在MaizeGDB中将ZmEGP基因序列与已公布的B73基因组序列比对,推测ZmEGP为单拷贝基因,且位于第2条染色体。3.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-PCR）结果显示ZmEGP无组织特异性。在幼苗中,ZmEGP在2个自交系各组织中的表达趋势一致,均为茎>叶>根,且在丹232中的相对表达量比在N04中偏高;在籽粒中,ZmEGP基因在丹232授粉后33 d（DAP）胚乳中的表达水平偏高,而在其余各组织及发育时期均低于N04中的表达水平。4.构建原核表达载体pEASY-ZmEGP,0.5 mM的IPTG诱导ZmEGP蛋白表达后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测,结果显示融合有His Tag的重组子经诱导后在47.80kDa大小处有一条表达量明显增多的蛋白条带,Western Blot分析结果与原核诱导相一致,证明ZmEGP基因确实可在体外被诱导而表达蛋白质。5.运用Western Blot分析从蛋白水平上对2个玉米自交系籽粒不同组织及不同发育时期的总蛋白进行杂交,结果发现ZmEGP蛋白在果皮中的信号相对于胚乳较弱。综合在RNA水平上的表达分析结果可知,ZmEGP蛋白主要在胚乳中表达,在果皮中的表达相对较弱,且在N04自交系中的信号稍强,与iTRAQ蛋白定量结果相一致。6.构建ZmEGP基因超表达载体转化拟南芥,转基因后代用潮霉素进行筛选至T2代,对转基因植株进行高盐和干旱逆境处理,发现在干旱条件下阳性植株与对照间并无差别,而在盐处理下转ZmEGP基因拟南芥表现出高盐耐性。