乙型脑炎病毒(JEV)属于黄病毒科黄病毒属，是一种虫媒病毒，它是诱发病毒性脑炎主要病原之一。在全世界范围内每年有大约67900例乙型脑炎患者，对人类的健康造成挑战。但是目前还没有批准的可用于临床治疗的药物，并且JEV的疫苗并非对所有的病毒株都有很好的预防效果。因此迫切需要开展相关研究，研发新的抗病毒药物。重组复制子病毒颗粒(RVPs)可用于抗病毒药物高通量筛选，也可以用于病毒结构蛋白突变研究。此外，由于RVPs是单复制周期病毒，可以利用这个特点设计新的、安全性更高的疫苗。在本文的研究中，我们通过共转染病毒复制子RNA和病毒结构蛋白表达质粒，建立了包装RVPs的系统。通过考察培养温度，转染质粒剂量和转染时间对包装效率的影响，我们得到了RVPs包装的最佳条件。此外，实验中还通过免疫荧光实验和药物抑制实验完成对RVPs的鉴定。在药物抑制实验中，JEV的几种进入抑制剂:氯喹，巴佛洛霉素A1和MβCD同样对RVPs感染有抑制作用。此外，下调细胞质子泵vATPase均能抑制JEV野生型病毒株AT31和RVPs的感染。这证实了RVPs具有AT31类似的感染特性。目前对JEV入侵早期阶段所发生的宿主-病毒相互作用的研究较少。泛素-蛋白酶体系统是细胞内重要的蛋白降解途径，它介导多种细胞进程，包括内吞过程，信号转导等，而这两种进程可能涉及到病毒入侵过程。但是，泛素-蛋白酶体系统是否真正参与JEV入侵的早期过程仍然不清楚。在此次研究中，我们发现蛋白酶体抑制剂MG132和lactacystin都能够有效地破坏JEV增殖性的入侵过程，这两种抑制剂主要作用于病毒在细胞内的囊泡运输过程，具体的作用节点发生在病毒跨膜之后和病毒基因组脱壳之后第一次翻译之前的阶段。通过使用共聚焦显微镜，我们观察发现，当用蛋白酶体抑制剂处理后，部分内吞的病毒粒子被引导进入溶酶体，导致不能形成成功的感染。此外，通过使用特异性的小干扰RNA(siRNA)，我们发现泛素化过程对于JEV的入侵是不可或缺的，JEV的包膜蛋白(E)能够被泛素化修饰，这说明E蛋白很可能在病毒入侵的过程中被泛素化。进一步地，通过免疫共沉淀实验我们发现JEV的E蛋白泛素化的类型是单泛素化;这种单泛素化可能作为一种内吞信号启动JEV的内吞进程。我们的研究证实了泛素-蛋白酶体系统对于JEV增殖性的入侵过程是不可或缺的，并且可能提供一种新的潜在的抗JEV感染的靶标。　　本研究筛选了FDA批准的药物分子库。这个分子库包含有1018种已经批准能在临床上使用的药物，因此被筛选到药物分子有可能可以直接应用于临床治疗。通过基于RVPs感染的体外筛选实验，在第一轮筛选中鉴定出抑制率大于90％的药物有28种。随后经过剂量依赖抑制实验和细胞活性实验，确认其中9种药物满足条件。然后挑选出其中SI指数大于10的5种药物，并在野生型病毒株AT31上进行验证，结果显示这些药物均有较好的抗病毒效果。进一步在时间梯度处理实验中，发现有5种药物均作用于病毒的复制阶段。在这5种药物中Manidipine，Cilnidipine，Benidipine这3种是具有相同的靶点——钙离子通道蛋白。通过研究其他三种钙离子相关抑制剂，发现JEV的感染过程与胞内钙离子水平的变化是密切相关的。因此推断筛选到的三种药物可能是通过抑制钙离子通道活性，下调胞内钙离子浓度从而抑制JEV感染。重点研究其中的钙离子通道蛋白抑制剂Manidipine，通过适应性突变研究发现，Manidipine在病毒上的作用位点可能是NS4B第130位的谷酰胺，但需要通过反向遗传学系统构建重组病毒进行验证。我们还发现候选5种药物对其他几种黄病毒包括ZIKV在内也有抑制作用，提示这些药物可能有一定的广谱抗黄病毒的活性。