论文部分内容阅读
目的：人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)和人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)具有无限增殖和多向分化潜能,目前能在体外条件下诱导hESC/hiPSC分化出多种血细胞,这些血细胞具有与外周血细胞相似的形态和功能。它们不仅为再生医学研究提供了丰富的细胞来源,而且为建立特异性疾病模型,最终实现临床个体化治疗提供了可能。人类脐带血造血干细胞(human umbilical cord blood-hematopoietic stem cell, hUCB-HSC),是脐带血中具有造血发生功能的干细胞,其不仅含量丰富,而且能分化为各种血细胞,能治疗多种血液系统疾病、恶性疾病和自身免疫性疾病等。hUCB-HSC目前已作为常规造血干细胞来源广泛应用于临床治疗和研究。体外大量研究表明,hUCB-HSC同样能在体外条件下培养诱导分化为红细胞和各种血细胞,以及内皮细胞等。嗜酸性粒细胞(Eosinophils, Eos)是一种颗粒性白细胞,起源于骨髓造血干细胞,在骨髓内分化成熟后进入外周血。虽然Eos仅占外周血白细胞的0.5%-5%,但却是极重要的炎症介质细胞,在介导过敏反应、寄生虫感染和调节免疫系统中具有重要功能,是多种临床疾病的重要研究点和突破口。但目前无论是对嗜酸性粒细胞发育分化的研究还是对其特异性疾病治疗的探究都很少。虽然有部分将hUCB-HSC诱导出嗜酸性粒细胞的研究,但由于缺乏特异性表型分子的鉴定等,始终停留在方法学阶段,且尚无从hESC特异性分化诱导嗜酸性粒细胞的相关工作报道。鉴此,探讨嗜酸性粒细胞分化发育途径及其调控机制具有重要的理论和研究价值。本实验拟在体外条件下分别诱导hESC和hUCB-HSC均分化为Eos,并对两者诱导出的Eos从形态、表型分子鉴定及胞内颗粒蛋白表达等多方面进行研究和对比,深入探究Eos发育分化的调控通路,以及不同干细胞来源的Eos早期发育、分化、成熟的过程及异同,并为建立Eos相关疾病模型及药物筛选模型提供实验依据。方法：选取无基质细胞培养的hESC未分化集落与经13.3GrayX射线照射的小鼠主动脉-性腺-中肾区(Aorta-Gonad-Mesonephros,AGM)基质细胞AGM-S3共培养,培养出多能造血干/祖细胞,再进行悬浮培养,诱导分化为成熟嗜酸性粒细胞。同时,将共培养14天细胞回收和冻存的脐带血单个核细胞同时进行CD34+磁珠分选,将分选出的CD34+细胞在相同的体外条件下进行悬浮培养,每周对悬浮培养细胞进行计数、甩片、May-Giemsa染色观察细胞形态、免疫荧光染色观察Eos细胞内颗粒蛋白的表达、流式细胞学检测细胞表面标记的表达。结果：(一)hESC/AGM-S3共培养阶段,能产生大量的多能造血干/祖细胞,但仅能产生极少量Siglec-8+的早期Eos在后续的悬浮培养过程中,能产生大量高纯度EPO+、Siglec-8+的成熟Eos。(二)将共培养14天细胞回收并采用不同细胞因子组合进行悬浮培养3-4周可以获得不同纯度EPO+的成熟Eos。其中,在悬浮培养开始阶段(第一周),即在含血清的培养基中加入细胞因子GM-CSF的培养组合条件下,细胞不仅扩增能力最强,而且产生Eos的比例也最高,是最佳的实验方法。(三)随着悬浮培养时间延长,Eos颗粒蛋白EPO和MBP阳性率表达逐渐升高,而嗜碱性粒细胞(Basophils,Bas)颗粒蛋白标记2D7和pro-MBP1阳性率表达则逐渐下降,此阶段部分细胞同时表达Eos(EPO、MBP)和Bas(2D7、ProMBP1)表面标记。随着悬浮培养时间的延长,细胞逐渐成熟,Eos颗粒蛋白的表达明显增加,而Bas颗粒蛋白的表达逐渐降低。表明了在Eos分化发育过程中,早期的细胞经历了一个特殊的阶段,同时带有Eos和Bas的特征,随着分化发育的成熟,细胞逐渐失去Bas的颗粒蛋白而只表达Eos颗粒蛋白,成为成熟的Eos。(四)将共培养和脐带血中通过磁珠分选出来的CD34+细胞在最优的细胞因子组合条件下进行悬浮培养,两种细胞在细胞扩增和Eos分化方面均有明显差别。(五)流式细胞学观察发现成熟Eos表面分子Siglec-8表达水平呈现时间依赖性模式,与EPO表达水平趋势一致。CD34/CD88/Siglec-8的表达也具有一定的时序性。结论：体外诱导hESC能分化出大量高纯度的功能成熟的Eos,其具有与外周血成熟Eos相似的表面标记和功能。悬浮培养早期即加入细胞因子(GM-CSF更有利于hESC来源Eos的扩增以及分化成熟,为最优化的实验方案。Eos分化成熟过程中的一特定阶段同时表达Eos和Bas颗粒蛋白,此现象与外周血及脐带血干细胞来源的Eos相同。Siglec-8是成熟嗜酸性粒细胞的表面标记,可以用来观察Eos早期发生、发育及分化成熟过程。hESCS和hUCBSC诱导分化出成熟的Eos在时间和效率上均有较大差别,hUCBSC所需时间较长且效率明显低于hESCS.