R-藻红蛋白荧光标记抗体是一种新型的荧光探针，具有传统荧光物无法比拟的优越性，可应用于荧光激活细胞分类、流式细胞仪荧光测定、荧光免疫检测以及单分子检测等多项技术，在医学诊断、动植物检疫、细胞生物学和分子生物学等诸多领域中得到应用。本论文主要从条斑紫菜R-藻红蛋白提纯、荧光标记抗体的制备、优化以及检测技术等方面进行了研究。主要研究内容如下： 1.R-藻红蛋白的纯化与性质鉴定本实验按照自行建立的流程成功地从紫菜中提取低成本高纯度的R—PE，为下一步制备廉价的R-藻红蛋白荧光标记物打下了基础。并分别通过紫外光谱扫描、层析、电泳、结晶等方法对藻红蛋白的性质进行鉴定。 紫外分光光度计检测证明所得R-藻红蛋白吸收光谱为双峰型且纯度达到4.6以上；而层析及非变性电泳都显示只有一个峰及一个条带，表明纯度已达到后续实验要求；结晶实验则表明：R-藻红蛋白较适合结晶的pH大致在6.0左右，两周后得到晶体，且在十周后仍未分解，所得晶体大小在0.02mm×0.02mm×0.1mm左右，红色，有折光现象，进一步说明所得R-藻红蛋白的纯度较高；用激发光分别照射载玻片和硝酸纤维素膜上的条斑紫菜R-藻红蛋呈橙黄色荧光，其结果证明其荧光特性良好，可用于荧光标记检测。 2.荧光标记物制备方法研究本实验在确定所用实验材料及对材料性质鉴定的基础上，通过对于三种不同的交联试剂对于R-PE的影响及不同交联方法的比较，以确定蛋白交联的方法包括反应时间、试剂种类及浓度的控制及制备流程。 首先比较了不同浓度交联试剂对藻红蛋白性质及荧光强度的影响，发现戊二醛作用于R—PE较适合的浓度为0％-0.2％；高碘酸钠作用于R—PE较适合的浓度为0-20mmol/L；而SPDP作用于R—PE较适合的摩尔比则为0-350。其次，分别选取0.2％的戊二醛、20mmol/L的高碘酸钠与SPDP：R—PE为20进行交联产物的制备与检测。最后通过对于各自层析图和电泳图的比较，发现由于戊二醛使用量的难以确认及高碘酸钠法易出现多聚合产物等原因，确定前两种都不太适合用于R—PE荧光标记物的制备。只有SPDP&DTT组合法较适合荧光抗体的制备，并初步确定了制备流程，即用异功能试剂SPDP活化R—PE，DTT疏基化抗体，经透析法分别去除溶液中多余的SPDP和DTT后混合交联反应，制备的荧光标记混合物过凝胶层析柱，获得R—PE荧光标记的抗体。 3.R-藻红蛋白荧光标记物制备条件优化本实验在上一章研究的基础上，以自制的高纯度条斑紫菜R—PE为材料，着重探讨缓冲液pH及反应的温度对于藻红蛋白荧光性质的影响、比较了三种常用的蛋白浓缩法以及交联试剂与物质摩尔比对交联效果的影响，对整个交联过程进行了条件优化和质量跟踪，旨在初步制备高纯度R—PE荧光标记的第二抗(羊抗兔抗体)，为建立高质量、低成本且简便的荧光探针制备工艺奠定基础。 首先，确定R-藻红蛋白在交联反应时最好在低温(5℃左右)、避光条件下进行，而所选用的反应缓冲液的pH值以6.8为适宜。其次，在三种蛋白浓缩方法中以超滤法对R—PE蛋白性质影响最小且回收率高，所以选用超滤离心管对蛋白进行浓缩及脱盐处理。最后通过一系列的比较实验确定了R—PE与SPDP按摩尔比为1：40进行衍生化，同时以DTT与IgG摩尔比为500：1进行巯基化。经交联过柱分离后所得的交联产物与原方法相比不仅大大降低了交联过程中的反应物损失，而且显著提高了交联产率并已初步制成高纯度产品。 4.R-藻红蛋白荧光标记物的应用及免疫检测技术在制备了高纯度R-藻红蛋白荧光标记的第二抗(羊抗兔抗体)的基础上，分别通过以NC膜为载体的免疫检测、单细胞盐藻中的定位实验以及肝癌SMCC-7721细胞的检测应用等免疫检测手段以确定制得R-藻红蛋白荧光标记抗体是否保持了良好的荧光性和特异性，为R—PE荧光探针的实际应用奠定基础。并在确定R-藻红蛋白荧光标记抗体的制备流程之后，初步探索藻蓝蛋白(PC)荧光标记抗体的制备条件及以NC膜为载体进行免疫检测。 通过以NC膜为载体的免疫检测、单细胞盐藻中的定位实验以及肝癌SMCC-7721细胞的检测应用等免疫检测显示对照组与检测组区别明显，证明了经优化后所制备的R-藻红蛋白荧光标记抗体不仅特异性保持了完好而且荧光强度大完全能用于细胞中的免疫检测。特别是对于SMCC-7721细胞的检测，在绿色荧光激发下红色细胞形态清晰完整，说明R-藻红蛋白荧光标记后的抗体能与一般肿瘤细胞发生特异性结合。 此外还基本建立了对于固相载体、悬浮细胞及贴壁细胞的荧光免疫检测流程，初步确定在选用绿色滤光片检测R-藻红蛋白荧光标记物能更好地保证免疫检测的效果。而藻蓝蛋白(PC)荧光标记抗体制备与检测的实验结果证明藻蓝蛋白荧光标记抗体的制备基本成功，为以后藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白荧光标记抗体的制备做了有效的尝试。