目的:目前针灸临床常用针刺“百会”和“印堂”二穴治疗抑郁症,但是其作用机理尚不清楚。本研究运用中医针灸理论精髓,结合动物行为学检测、清醒活动状态下神经递质检测和荧光发光值测定法等手段在由母婴分离（MS）造成的大鼠抑郁症样模型上探索电针“百会”和“印堂”抗抑郁的可能机制。从抑郁症的外表型到内表型,针对可能的抑郁症的发病机制检测MS抑郁症样大鼠在关键脑区前额叶皮层（PFC）中多种神经递质、皮质酮（CORT）和三磷酸腺苷（ATP）的水平变化,探讨可能的电针“百会”、“印堂”治疗MS抑郁症的关键神经生物学机制。研究结果不仅有利于进一步理解MS抑郁症的发病机理,而且为将来针灸在抑郁症等精神疾病治疗和推广应用中提供理论依据,为抑郁症等情志病的治疗提供新的思路和靶点。实验一 经历过母婴分离造模的大鼠分别在青少年期和成年期的行为学表现方法:1.动物造模及分组方法:将孕期的Wistar母鼠独笼饲养,分为健康对照组和造模组。定仔鼠出生的第一天为PNDO.在造模组中,从PND1-PND21每天8:30-13:30AM将母鼠转移出饲养笼,使仔鼠连续21天每天失去母亲的照拂4个小时。在健康对照组中,母鼠和仔鼠共同生活在一个饲养笼内不予打扰,直至PND22天时候断奶,需将两个组的母鼠全部转移,留下的幼鼠开始雌雄分笼,雄鼠留下每5:只一笼饲养,雌鼠淘汰。①PND22-PND50的幼鼠分为青少年正常组y-Cont（未进行过母婴分离干预的雄性子代）和青少年模型组y-MS（进行过母婴分离干预的雄性子代）。②PND60为Wistar大鼠的成年期。将第PND60天的子代分为正常组Cont（未进行过母婴分离干预的雄性子代）和模型组MS（进行过母婴分离干预的雄性子代）。2.评价指标:断奶第1周:糖水偏爱实验（SPT）,断奶第2周:旷场实验（OFT）,断奶第3周:高架十字实验（EPT）,断奶第4周:强迫游泳实验（FST）;成年后第1周:糖水偏爱实验（SPT）,成年后第2周:旷场实验（OFT）,成年后第3周:高架十字实验（EPT）,成年后第4周:强迫游泳实验（FST）。3.统计方法:数据采用均数±标准误（x±SEM）表示,运用SPSS 22.0及Graphpad prism 7对数据进行统计分析和做图。单纯两组之间的对比采用独立样本T检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.断奶第1周,与y-Cont组相比,y-MS组大鼠糖水的偏爱度并无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。2.断奶第2周,与y-Cont组相比,y-MS组大鼠在旷场的总路程,四周的路程上明显偏高,差异有统计学意义（P<0.05）,在中央区的停留时间上,y-MS组大鼠明显少于y-Cont组大鼠,穿越中央区的速度明显快于y-Cont组大鼠,穿越次数明显增多。3.断奶第3周,与y-Cont组相比,y-MS组大鼠在高架十字迷宫的开臂停留时间和开臂路程明显减少（P<0.05）,在闭臂停留的时间和闭臂路程明显增多（P<0.01）,在中央区的时间无明显差异。4.断奶第4周,与y-Cont组相比,y-MS组大鼠强迫游泳不动时间明显延长（P<0.001）。5.成年后第1周,与Cont组相比,MS组大鼠的糖水消耗显著减少（P<0.001）。6.成年后第2周,与Cont组相比,MS组大鼠在旷场的总路程,四周的路程和中央停留时间和穿越速度上均无差异（P>0.05）。7.成年后第3周,与Cont组相比,MS组大鼠在高架十字迷宫的开臂停留时间、开臂路程、闭臂停留的时间和闭臂路程的表现均无明显差异（P>0.05）。8.成年后第4周,与Cont组相比,MS组大鼠的强迫游泳不动时间明显延长（P<0.01）。结论:1)断奶第1周,y-MS大鼠未表现出快感缺乏的抑郁症样表现;2)断奶第2周,y-MS大鼠表现出可能为多动或者躁狂的行为倾向;3)断奶第3周,y-MS大鼠出现明显的焦虑样表现;4)断奶第4周,y-MS大鼠出现代表绝望行为的抑郁症样表现;5)成年后MS大鼠出现稳定的抑郁症样表现包括快感缺乏症状和绝望行为而不呈现焦虑样改变。实验二 电针“百会”、“印堂”穴对MS大鼠的抑郁样行为改善作用方法:1.动物造模与分组:造模方法同实验一。在PND60将参与母婴分离造模的子代雄性Wistar大鼠随机分为MS组（模型对照组）、MS+EA组（模型+电针组）、MS+Sham-EA组（模型+假电针组）。为减少不同窝大鼠造成的差异,每组大鼠均来自不同的4只母鼠生成的子代大鼠。未参与造模的雄性子代为Cont组（空白对照组）。2.干预措施:实验大鼠干预治疗在PND61开始进行。①电针干预组:电针干预组选取“百会”（GV20）和“印堂”穴（GV29）参考《实验针灸学》进行针刺治疗。实验大鼠在异氟烷麻醉状态下进行电针,先用4%的异氟烷和氧气的混合气体诱导麻醉,约5分钟后大鼠麻倒。麻醉后大鼠固定在瑞沃德麻醉剂面罩装置上,以2%的异氟烷维持轻度麻醉状态。然后用75%酒精消毒穴位的皮肤,用华佗牌不锈钢针灸针（0.25*13mm）,刺入“百会”穴和“印堂”穴约5 mm,然后连接到Master8电刺激仪,接通电流。刺激强度设置参数如下:电流为2 mA,频率为2 HZ,电针时间为15 min。每天上午8:30开始电针,每隔1天电针1次,一共治疗21天。②假电针干预组:假电针组大鼠麻醉方法同电针组,约在“百会”穴和“印堂”穴平行旁开3mm的位置皮肤消毒后将针灸针的针尖轻轻触碰皮肤,而针不刺入。不连接Master8电刺激仪,而以2%的异氟烷维持轻度麻醉状态持续15min。隔1天治疗1次,一共治疗21天。③其他组别:模型对照组和空白对照组均接受与电针和假电针组等量的异氟烷氧气混合气体麻醉干预,麻醉方法同电针治疗组。隔1天干预1次,一共干预21天。3.评价指标:所有组别均在治疗结束后第1天开始进行行为学检测。旷场活动测试（OFT）、高架十字测验（EPT）、强迫游泳（FST）和糖水偏爱实验（SPT）。4.统计方法:数据采用均数±标准误（x±SEM）表示,运用SPSS 22.0及Graphpad Prism 7对数据进行统计分析和做图。多组之间的数据比较,当方差齐时采用单因素方差分析one-way ANOVA-LSD检验法,当方差不齐时运用非参数检验K-S检验法。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.OFT结果显示,各组在总路程和中央区的路程上无明显差异（P>0.05）,EPT结果显示,各组在闭臂中的停留时间或开臂中的停留时间上亦均无明显差异（P>0.05）。2.SPT结果显示,与Cont组相比,MS组大鼠糖水的偏爱度显著降低（P<0.05）,而MS+EA组大鼠对糖水的偏爱度相比MS组明显升高（P<0.05）,与Cont组大鼠相比差异不明显（P>0.05）,MS+S ham-EA组大鼠糖水偏爱度与Cont组相比明显降低与MS组相比无差异（P>0.05）。3.FST结果显示,与Cont组相比,MS组大鼠不动时间明显延长（P<0.001）。与MS组相比,MS+EA组大鼠在强迫游泳中不动时间已明显减少（P<0.001）,尽管未改善至与Cont组的行为一致（P<0.05）。而MS+Sham-EA组大鼠在强迫游泳中不动时间与MS组相较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1)生命早期每天4小时的母婴分离模型在成年期时不产生焦虑样病变,电针对成年期MS模型的焦虑样测试不产生作用,假电针的操作亦无影响;2)电针“百会”和“印堂”穴可改善母婴分离导致的成年大鼠抑郁症样快感缺失行为和绝望行为。实验三 电针“百会”、“印堂”对MS抑郁症样大鼠的PFC中神经递质和皮质酮水平的影响方法:1.动物造模、分组与干预:造模方法同实验一。除不设立MS+Sham-EA组,其他分组及干预方法同实验二。2.评价指标:①超高效液相色谱—三重四极杆质谱法检测PFC区组织上清液中的单胺类神经递质和乙酰胆碱（ACh）的含量。②超高效液相色谱一三重四极杆质谱法检测PFC区组织上清液中的皮质酮（CORT）含量。③活体微透析联合超高效液相色谱—三重四极杆质谱法检测PFC区脑脊液中的谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）的含量。3.统计方法同实验二。结果:1.在PFC组织中,与Cont组相比,MS组和MS+EA组大鼠PFC组织上清液中5-HT含量均明显降低（P<0.001）,与MS组相比较,MS+EA组的5-HT含量无明显改变（P>0.05）。NE和DA的含量改变类似5-HT。2.在PFC组织上清液中,与Cont组相比,MS组和MS+EA组的ACh的含量明显降低（P<0.001;P<0.05）,与MS组相比,MS+EA组的PFC组织上清液中Ach的含量有所升高,但是趋势不明显（P>0.05）。3.三组之间CORT的含量无明显差异（P>0.05）。4.在PFC区脑脊液中,与Cont组相比MS组大鼠的Glu含量无改变,GABA含量升高（P<0.05）,EA能够提升MS大鼠的Glu含量（P<0.05）,但是对升高的GABA无抑制作用。结论:1)电针“百会”、“印堂”发挥抗抑郁作用的机制可能不通过改变MS抑郁症样模型PFC区组织中的单胺类神经递质和ACh;2)电针“百会”、“印堂”发挥抗抑郁作用的机制可能不通过改变MS抑郁症样模型的PFC组织中CORT浓度;3)MS动物PFC局部脑脊液中的GABA浓度升高,电针“百会”、“印堂”可能通过提升MS动物PFC局部脑脊液中的Glu的含量从而相对抑制GABA,改善MS模型中枢神经系统兴奋性和抑制性神经递质之间的平衡关系从而发挥抗抑郁作用。实验四 电针“百会”、“印堂”改善MS大鼠抑郁样表现与PFC中ATP水平的关系方法:1.动物的造模同实验一。2.分组与干预:①将MS大鼠分成三组,分别为:母婴分离模型组（MS组）、电针治疗组（MS+EA组）,MS鼠腹腔注射ATP组（MS+ATP组）。其中,MS组、MS+EA组和空白对照组（Cont组）进行腹腔注射0.9%生理盐水的干预,按照1ml/kg的量进行注射。ATP组按一定的浓度进行腹腔注射ATP溶液的干预,同样按照1ml/kg的量进行注射。②在针灸干预结束之后,将电针组大鼠一部分用于脑立体定位PFC注射ACSF（MS+EA+Vehicle）,一部分用于脑立体定位PFC注射ATP拮抗剂suramin（MS+EA+Suramin）;未接受电针干预的MS大鼠一部分用于脑立体定位PFC注射ACSF（MS+Vehicle）,一部分用于脑立体定位PFC注射ATP激动剂（MS+ATP）;一部分健康空白大鼠用于接受脑立体定位PFC注射ACSF（Cont+Vehicle）,剩下部分的健康空白大鼠用于接受脑立体定位PFC注射ATP拮抗剂suramin（Cont+Suramin）。3.评价指标:①PFC组织中的UCP3基因的表达量。②PFC区脑脊液中ATP的含量。③腹腔注射ATP激动剂后,各组大鼠的糖水消耗量和强迫游泳不动时间。④脑立体定位分别注射ACSF、ATP和suramine三种药剂后的强迫游泳不动时间和旷场的总路程。4.统计方法同实验二。结果:1.取Cont组的值为对照值1,MS组的PFC中UCP3的表达明显高于Cont组（P<0.05）,与MS组相比,MS+EA组的PFC中UCP3的表达明显降低（P<0.05）。2.在PFC区脑脊液中,与Cont组相比,MS组的ATP的含量明显减少（P<0.01）,与MS组相比,MS+EA组的ATP含量明显升高（P<0.05）。3.给MS大鼠连续7天腹腔注射ATP激动剂后,与Cont组相比,MS组大鼠的糖水消耗量明显下降（P<0.001）,而电针能够逆转这种改变（P<0.01）。与Cont组相比,MS大鼠的不动时间明显升高（P<0.05）,电针能够逆转这种改变（P<0.05）。4.脑注射结束30min后立即进行强迫游泳的行为学测试,给MS大鼠的PFC注射ATP的激动剂,发现与注射vehicle的MS组大鼠相比,其不动时间显著降低（P<0.01）;当给健康的Cont组大鼠的PFC注射ATP拮抗剂suramin后,与注射vehicle的Cont组大鼠相比,其不动时间显著升高（P<0.05）;给MS+EA组大鼠的PFC注射ATP拮抗剂suramin后,与注射vehicle的MS+EA组大鼠相比,其不动时间也显著升高（P<0.05）。5.各组大鼠再次进行脑立体定位注射,并在其休息30min后予旷场试验,各组之间在旷场的总路程上并无明显差异（P>0.05）。结论:1)PFC区的ATP水平下降可能是导致母婴分离MS模型抑郁症样表现的机制之一;2)电针“百会”和“印堂”通过提升PFC区的ATP水平可能是在母婴分离MS抑郁症样模型上发挥抗抑郁作用的关键机制。