d-阿拉伯糖醇高产多形汉逊酵母重组菌株选育及其发酵工艺研究

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D-阿拉伯糖醇,已在食品、化工、医药等领域有着广泛的应用。然而,传统的直接提取法和化学合成法的生产工艺存在产率低,底物昂贵等弊端,限制了D-阿拉伯糖醇的规模化生产。生物发酵法生产D-阿拉伯糖醇被公认为绿色生产方法,也是最有前景的生产方法之一。但是目前用于发酵生产D-阿拉伯糖醇的菌株普遍存在产率低,副产物多等问题。因此,选育出一株遗传性能良好的高产菌株尤为重要。  本研究首先对低能N+注入多形汉逊酵母DL-1(Hansenula polymorphaDL-1,H.polymorpha DL-1)的注入参数进行考察,确定了最佳的低能离子注入参数。进而根据D-阿拉伯糖醇高产菌株有耐高渗的特性,建立了高糖培养基初筛,纸色谱法和高效液相色谱法联合使用进行复筛的高通量筛选方法。再利用离子束转基因技术介导多形汉逊酵母基因组DNA随机转化多形汉逊酵母,结合高通量筛选方法,创建D-阿拉伯糖醇高产重组菌株。随后对高产重组菌株发酵生产D-阿拉伯糖醇的发酵工艺进行考察,确定了高产重组菌株发酵生产D-阿拉伯糖醇的最佳发酵工艺。研究结果如下:  (1)对多形汉逊酵母低能离子注入剂量和能量进行优化,依据多次重复试验计算出注入菌株的存活率,获得“马鞍形”曲线,确定出低能N+注入多形汉逊酵母的最佳条件:注入剂量:2.5×1016 ion/cm2;注入能量:25keV,真空条件下,脉冲注入10s,间隔10s。  (2)建立了高通量筛选方法,即高糖培养基初筛,纸色谱法和高效液相色谱法复筛的组合利用的高通量、快速筛选方法。  (3)运用低能离子束技术构建高产重组菌株,结合高通量筛选方法筛选出了一株产量为113.76g/L的高产工程菌株,被命名为H.polymorphaDLg4-14。  (4)以H.polymorpha DLg4-14为研究对象,运用正交试验确定了其最佳发酵条件,分别为接种时间21h,接种量5%,葡萄糖添加量为250g/L,酵母膏:硫酸铵(mol/mol)=10∶1。其中,葡萄糖的添加量对D-阿拉伯糖醇的产量有着显著的影响。在此条件下,D-阿拉伯糖醇产量为119.03g/L,转化率提高了4.63%。  (5)以H.polymorpha DLg4-14为研究对象,确定了最佳变温方案,即将高产重组菌株先在最适生长温度37℃恒温培养24h后,再升温至极限温度48℃恒温培养24h,最后降温至最适发酵温度34℃继续恒温培养80h;在此条件下,D-阿拉伯糖醇产量为123.92g/L,相比于恒温发酵最高产量(119.46g/L)提高了3.73%。
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