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头颈部鳞癌(Squamous cell carcinoma of head and neck,SCCHN)患者的死亡率较高,主要原因是在确诊时已经存在淋巴结转移。趋化因子受体7(Chemokinereceptor7,CCR7)是CC族趋化因子受体的成员,主要生物学功能是T细胞、B细胞和树突状细胞向次级淋巴组织归巢,CCL19和CCL21是其配体。学者们认为CCR7阳性肿瘤细胞向淋巴结转移的机制可能与淋巴细胞的趋化归巢类似。有研究表明SCCHN高表达CCR7,并与颈部淋巴结转移密切相关。与低表达CCR7的头颈部鳞癌细胞相比,高表达CCR7的头颈部鳞癌细胞侵袭及转移能力明显增加,NF-κB活性增强,CCL19诱导能够保护SCCHN细胞使其免于顺铂诱导的凋亡。CCR7下游信号通路非常复杂,PI3K、PLC及NF-κB已经被证实是其下游信号因子,但具体的细胞内信号转导通路机制还未完全阐明。
MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,在单细胞真核生物以及包括哺乳动物在内的多细胞生物体内都是高度保守的蛋白结构,在哺乳动物细胞中有三个主要的分子成员:ERK1/2, JNK,和p38,他们广泛调节着多种细胞的趋化和运动能力。
已经证实,在多种癌症细胞中,不同的刺激因素可以导致MAPK家族的一员或多员活化。但是在实体肿瘤的转移方面,尚未见到关于CCR7与MAPK信号通路关系的研究。
实验方法:
使用CCL19作用头颈鳞癌细胞系PCI-4B和PCI-37B不同时间后,westernblotting方法检测MAPK家族的ERK1/2、JNK和p38总蛋白和磷酸化水平的变化,确定CCL19激活MAPK家族的具体分子及适宜时间;使用ERK1/2和JNK的抑制剂预处理细胞后,再以western blotting方法检测ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平的变化,明确ERK1/2和JNK之间的相互作用关系。
使用各抑制剂预处理细胞,然后CCL19诱导,Transwell小室检测细胞的迁移侵袭等能力的变化,划痕实验检测细胞在创缘边缘的迁移速度。
使用CCL19诱导,western blotting方法检测CCR7下游靶分子E-cadherin和Vimentin的表达,以及各种抑制剂预处理后细胞内的E-cadherin和Vimentin的表达变化,探讨CCR7及其下游ERK1/2和JNK信号通路调节肿瘤细胞转移的机理。
在78例头颈鳞癌组织标本和10例正常粘膜标本中,使用免疫组化进行染色,观察CCR7、磷酸化ERK1/2和磷酸化JNK的表达强度,分析与肿瘤的发生、转移的关系,以及各分子之间的关系。
实验结果:
头颈鳞癌细胞系PCI-4B和PCI-37B中,CCL19能够诱导ERK1/2和JNK的磷酸化,且呈时间依赖性,而对p38无明显作用。CCR7 mAb预处理后,CCL19诱导的ERK1/2和JNK磷酸化水平均降低。同时使用ERK的特异性抑制剂PD98059和JNK的抑制剂SP600125预处理两种细胞系,结果显示PD98059和SP600125能够分别抑制ERK1/2和JNK的磷酸化,表明抑制效果的可靠性。结果还显示,在PCI-4B和PCI-37B两种细胞系中,PD98059并不能抑制JNK的磷酸化,而SP600125也不能抑制ERK1/2的磷酸化后,提示ERK1/2和JNK在CCR7的下游通路中是平行、互不干扰的关系。
CCL19作用后,两种细胞的迁移和侵袭能力提高2倍左右,与空白对照组相比,具有显著性差异(P<0.05),而CCR7 mAb预处理后,细胞迁移能力恢复到接近空白对照组水平,与CCL19处理组相比,同样具有显著性差异(P<0.05)。分别使用ERK1/2的抑制剂PD98059和JNK的抑制剂SP600125预处理细胞,结果显示,CCL19诱导的PCI-4B和PCI-37B两种细胞的迁移能力受到显著的抑制,仅略高于空白对照组水平,与CCL19处理组相比,具有显著性差异(P<0.05)。
划痕实验中,0h时各组划痕宽度基本一致;12-24h时,CCL19组划痕缩窄明显,与空白对照组存在显著性差异(P<0.05)。而使用ERK的特异性抑制剂PD98059和JNK的抑制剂SP600125预处理细胞后,CCL19对细胞的迁移作用受到显著抑制,无论是在12h还是在24h,CCL19+PD98059组和CCL19+SP600125组细胞的划痕宽度与CCL19组相比,都具有显著性差异(P<0.05)。
CCL19处理细胞后,E-cadherin蛋白表达水平显著下降,而Vimentin的表达水平显著升高,使用CCR7 mAb阻断CCR7的作用后,CCL19诱导的E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平恢复至空白对照水平;使用ERK1/2的抑制剂PD98059和JNK的抑制剂SP600125预处理细胞,然后CCL19刺激,结果得到和CCR7 mAb类似的效果,即PD98059和SP600125明显抑制了CCL19对E-cadherin和Vimentin的作用,使E-cadherin表达上调,而Vimentin表达下调,最终都接近空白对照水平。
78例头颈鳞癌原发灶标本中,CCR7阳性表达48例(48/78),磷酸化ERK1/2阳性表达46例(46/78),磷酸化JNK阳性表达41例(41/78),三种蛋白在头颈鳞癌原发灶及口腔正常粘膜中的表达均具有显著性差异(P<0.05),并且都与肿瘤临床分期及是否发生淋巴结转移相关(P<0.05)。并且CCR7表达与磷酸化ERK1/2表达或与磷酸化JNK表达也均呈相关性(P<0.05)。
结论:
1.头颈鳞癌中,CCR7能够激活其下游ERK1/2和JNK两条信号通路,而对p38信号通路没有显著性作用。
2.ERK1/2和JNK信号通路互相平行,不存在交叉和上下级联关系。
3.CCR7通过ERK1/2和JNK两条信号通路调节E-cadherin和Vimentin的表达。
4.ERK1/2和JNK信号通路在CCR7调节头颈鳞癌细胞的侵袭迁移等生物学行为中起到重要的作用。
5.CCR7、磷酸化ERK1/2和磷酸化JNK与头颈鳞癌的临床转移密切相关。